本氏烟NbRFP蛋白调控燕麦矮缩病毒RepA诱导HR的分子机制研究

发布时间：2022-08-10 15:36

　　燕麦矮缩病毒（Oat dwarf virus,ODV）是双生病毒科玉米线条病毒属的一个典型成员,其编码的RepA蛋白是一个诱导植物过敏性反应（HR）的效应子。前期研究以ODV的RepA作为诱饵蛋白,通过酵母双杂交系统从本氏烟的cDNA文库中筛选到NbRFP是与RepA互作的候选互作因子之一。为了深入解析RepA诱导HR反应的分子机理,本研究对NbRFP和RepA的互作进一步进行了体内和体外验证,并探讨了这种互作调控RepA诱导HR的分子机制。从本氏烟中克隆了 NbRFP蛋白的全长cDNA序列,序列比对结果显示其与普通烟上分离到的NtRFP蛋白的氨基酸序列同源性高达97%,而NtRFP已被证明是一个典型的RING型的E3泛素连接酶。利用qRT-PCR进行NbRFP蛋白的组织特异性检测,发现其于花期之前在根和叶中表达量较高,而在花期则在根和花中表达量较高。进一步利用激光共聚焦显微镜观察NbRFP蛋白的亚细胞定位,发现其定位于烟草表皮细胞的细胞核和细胞质中。为了验证NbRFP和RepA的互作,将NbRFP的全长cDNA构建到pGADT7载体上,并将RepA构建到pGBKT7载体上,通过酵母双... 

【文章页数】：99 页

【学位级别】：硕士

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致谢
摘要
Abstract
第一章 绪论
    1.1 HR是植物的一种免疫反应
        1.1.1 HR的定义
        1.1.2 HR与植物免疫反应的Z-模型
    1.2 病毒侵染诱导HR的研究
        1.2.1 植物应对病毒的免疫反应
        1.2.2 病毒侵染诱导HR的相关研究
        1.2.3 双生病毒侵染诱导HR的相关研究
            1.2.3.1 双生病毒的分类和基因组结构
            1.2.3.2 双生病毒编码HR效应子的相关研究
    1.3 E3泛素连接酶参与调控植物的免疫反应
        1.3.1 E3泛素连接酶概况
        1.3.2 E3泛素连接酶参与植物-病原物互作
第二章 材料与方法
    2.1 材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 菌株和载体
        2.1.3 试剂与仪器
        2.1.4 常用缓冲液的配制
    2.2 常规实验方法
        2.2.1 培养基配制方法
            2.2.1.1 LB培养基
            2.2.1.2 YEP培养基
            2.2.1.3 麦康凯培养基
        2.2.2 常规分子克隆实验技术
            2.2.2.1 普通PCR反应
            2.2.2.2 高保真PCR反应
            2.2.2.3 PCR产物回收与纯化
            2.2.2.4 连接与酶切
            2.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞制备与转化
            2.2.2.6 质粒小量提取
    2.3 农杆菌相关实验技术
        2.3.1 农杆菌感受态细胞制备
        2.3.2 电击转化
        2.3.3 农杆菌瞬时浸润
    2.4 植物叶片总RNA提取
    2.5 RT-PCR和qRT-PCR
        2.5.1 RT-PCR
        2.5.2 Real-time quantitative PCR (qRT-PCR)
    2.6 蛋白实验相关技术
        2.6.1 叶片总蛋白提取
        2.6.2 SDS-PAGE
        2.6.3 Western blot技术
            2.6.3.1 电转移
            2.6.3.2 Western印记分析
    2.7 酵母双杂交
第三章 本氏烟NbRFP对ODV RepA诱导HR的影响
    3.1 材料与方法
        3.1.1 材料
        3.1.2 引物
        3.1.3 方法
            3.1.3.1 酵母转化(LiAc法)
            3.1.3.2 蛋白的酵母互作验证
            3.1.3.3 同源序列比对及功能域分析
            3.1.3.4 TRV病毒诱导的基因沉默
            3.1.3.5 qRT-PCR分析
            3.1.3.6 NbRFP基因的组织特异性表达分析
            3.1.3.7 转基因过表达及阳性鉴定
            3.1.3.8 双分子荧光互补实验(BiFC)
            3.1.3.9 免疫沉淀反应(Co-immunoprecipitation,Co-IP)
    3.2 结果与分析
        3.2.1 NbRFP基因的克隆与序列分析
        3.2.2 酵母双杂验证NbRFP蛋白与RepA的互作
        3.2.3 BiFC验证NbRFP与RepA蛋白在植物体内的互作
        3.2.4 Co-IP验证NbRFP与RepA蛋白在植物体内的互作
        3.2.5 NbRFP表达的组织特异性分析
        3.2.6 NbRFP在烟草中的亚细胞定位
        3.2.7 RepA蛋白显著上调NbRFP mRNA的表达水平
        3.2.8 沉默NbRFP对RepA诱导HR的影响
        3.2.9 过表达NbRFP对RepA诱导HR的影响
        3.2.10 NbRFP与RepA蛋白互作结构域的鉴定
        3.2.11 NbRFP的RING finger domain对RepA诱导HR的影响
    3.3 讨论
第四章 过表达NbRFP后ODV RepA诱导HR的表达谱分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 材料
        4.1.2 方法
            4.1.2.1 接种和取样
            4.1.2.2 建立文库和测序
            4.1.2.3 标准信息分析流程
    4.2 结果与分析
        4.2.1 数据比对和质控
        4.2.2 基因定量分析
        4.2.3 生物学重复的样品表达谱测序数据的相关性分析
        4.2.4 显著差异基因分析
        4.2.5 差异基因的GO功能显著性富集分析
        4.2.6 差异基因的Pathway显著性富集分析
    4.3 讨论
第五章 全文小结
参考文献
附录Ⅰ 常用生化及分子生物学试剂与仪器
附录Ⅱ 常用缓冲液配方
附录Ⅲ 本论文中所用术语缩写与中英文对照


【参考文献】：
期刊论文
[1]河北东部沿海地区野生大豆病毒病抗性与几种酶活性的关系[J]. 史凤玉,朱英波,龙茹,杨晴,李海潮,李桂兰,乔亚科.  植物病理学报. 2008(04)



本文编号：3673897