镰刀菌对氰烯菌酯的抗药性机制及响应调控机制的研究

发布时间：2022-12-08 01:05

　　镰刀菌（Fusarium）属于丝状子囊真菌,它能引起许多危害严重的世界性病害,其中包括枯萎病,赤霉病,根、茎的腐烂及溃疡病等,在农业生产上造成了严重的产量损失及经济损失。此外,镰刀菌还能产生多种毒枝菌素的次级代谢物,比如单端孢霉烯族毒素类及伏马菌素毒素类,污染农产品,严重威胁了人类及动物的健康。广义上的禾谷镰刀菌（有性态Gibberella zeae（Schwein.）Petch）是造成小麦赤霉病（Fusarium head blight,FHB）及其他谷类作物病害的主要致病菌。禾谷镰刀菌是一种复合种,由于世界各地的耕作系统及气候条件的不同,引发小麦赤霉病的优势种群也有所不同。到目前为止,共有13个独立的系统发育种被鉴定出来。在中国,引发小麦赤霉病的优势种主要是禾谷镰刀菌（Fusarium graminearum s.str.）和亚洲镰刀菌（Fusariumasiaticum）。尖孢镰刀菌（F oxysorum）是一种能够侵染多达150多种作物的致病菌,造成冠腐、根腐以及枯萎病。此外,有的尖孢镰刀菌专化型还能引起人类的灰指甲、角膜炎及皮肤病。目前,农业生产上的许多重要镰刀菌病害如小麦赤... 

【文章页数】：194 页

【学位级别】：博士

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摘要
ABSTRACT
符号及缩略说明表
绪论
第一章 文献综述
    1 镰刀菌的研究进展
        1.1 禾谷镰刀菌的研究现状
            1.1.1 禾谷镰刀菌分类的研究进展
            1.1.2 禾谷镰刀菌毒素的研究进展
        1.2 尖孢镰刀菌的研究进展
            1.2.1 尖孢镰刀菌的分类
            1.2.2 尖孢镰刀菌的侵染过程及防治方法
    2 杀菌剂氰烯菌酯的研究进展
        2.1 杀菌剂氰烯菌酯的概况
        2.2 杀菌剂氰烯菌酯的作用方式研究现状
        2.3 禾谷镰刀菌对氰烯菌酯抗性机制的研究进展
    3 镰刀菌基因组学及RNA-seq的研究进展
        3.1 镰刀菌基因组学研究进展
        3.2 镰刀菌RNA-seq研究进展
    参考文献
第二章 禾谷镰刀菌对氰烯菌酯抗药性相关基因FgpsB的功能研究
    1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒、杀菌剂与培养基
        1.2 试剂
        1.3 分子生物学技术
            1.3.1 禾谷镰刀菌基因组DNA的提取
            1.3.2 禾谷镰刀菌总RNA的提取
            1.3.3 常规PCR反应体系及程序
            1.3.4 Double-joint PCR反应体系及程序
            1.3.5 反转录PCR(RT-PCR)
            1.3.6 荧光定量PCR (qRT-PCR)
            1.3.7 Southern Blot
        1.4 禾谷镰刀菌FgApsB基因的序列及系统进化分析
        1.5 禾谷镰刀菌FgApsB基因敲除及回复载体的构建
        1.6 转化子验证
            1.6.1 药剂验证
            1.6.2 PCR验证
            1.6.3 cDNA验证
            1.6.4 Southem杂交验证
        1.7 FgApsB基因敲除突变体表型分析
            1.7.1 对氰烯菌酯敏感性测定
            1.7.2 菌丝生长速率及产孢量分析
            1.7.3 对渗透压、细胞壁胁迫、细胞膜胁迫的敏感性测定
            1.7.4 菌丝形态、芽管和分生孢子的显微观察以及细胞核染色的荧光观察
            1.7.5 致病力实验
            1.7.6 离体产DON毒素能力测定
        1.8 FgApsB基因敲除突变体对色素合成途径、毒素合成途径以及细胞壁胁迫中关键基因的表达量影响
    2 结果与分析
        2.1 禾谷镰刀菌FgApsB基因的序列及系统进化分析
        2.2 禾谷镰刀菌FgApsB基因敲除突变体和回复突变体的转化子验证
        2.3 禾谷镰刀菌FgApsB基因敲除突变体和回复突变体的表型分析
            2.3.1 对氰烯菌酯敏感性的测定
            2.3.2 菌丝生长速率测定及菌丝形态显微观察
            2.3.3 FgApsB基因在色素生物合成过程中的作用
            2.3.4 FgApsB基因在无性繁殖和细胞核迁移及定位中的作用
            2.3.5 FgApsB基因在细胞壁抗逆反应中的作用
            2.3.6 FgApsB基因对致病力的作用
            2.3.7 FgApsB基因对DON生物合成及相关基因表达的影响
    3 讨论
    参考文献
第三章 禾谷镰刀菌丝束蛋白FgFim对氰烯菌酯的抗性调控及功能研究
    1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒、杀菌剂与培养基
        1.2 试剂
        1.3 分子生物学技术
            1.3.1 Tail-PCR反应体系及程序
            1.3.2 Tail-PCR产物纯化,克隆,测序,比对
        1.4 禾谷镰刀菌对氰烯菌酯高抗药性菌株Y2021A的HPH-HSV-tk随机插入突变体库筛选
        1.5 禾谷镰刀菌FgFim基因的鉴定及序列分析
        1.6 禾谷镰刀菌FgFim基因敲除载体、回复载体及与Fgβ_2-tub双敲除载体的构建
        1.7 转化子验证
        1.8 敲除突变体的表型分析
            1.8.1 对氰烯菌酯敏感性测定
            1.8.2 菌丝生长速率及产孢量分析
            1.8.3 对渗透压、氧化压、金属离子胁迫、细胞壁胁迫、细胞膜胁迫的敏感性测定
            1.8.4 菌丝形态、分生孢子萌发及芽管伸长的显微观察
            1.8.5 菌丝胞内甘油含量测定
            1.8.6 产子囊壳及致病力实验
            1.8.7 禾谷镰刀菌侵染麦粒的产DON毒素能力测定
        1.9 基因表达分析
            1.9.1 FgFim敲除对细胞壁完整途径基因FgMkk1、FgSlt2、FgGls2的影响
            1.9.2 FgFim敲除对麦角甾醇合成基因Cyp51A,B,C的影响
            1.9.3 FgFim敲除对毒素合成基因Tri5和Tri6的影响
    2 结果与分析
        2.1 禾谷镰刀菌氰烯菌酯高抗菌株Y2021A的HPH-HSV-tk的随机插入突变体库的筛选及鉴定
        2.2 禾谷镰刀菌FgFim基因的鉴定及序列分析
        2.3 禾谷镰刀菌FgFim基因敲除突变体和回复突变体的转化子验证
        2.4 FgFim基因在禾谷镰刀菌的药敏性调控及其他生命活动中的作用
            2.4.1 对氰烯菌酯敏感性和抗药性水平的调控
            2.4.2 FgFim在禾谷镰刀菌菌丝生长和无性及有性繁殖中的作用
            2.4.3 FgFim在禾谷镰刀菌抗逆反应中的作用
            2.4.4 FgFim对禾谷镰刀菌致病力的影响
            2.4.5 FgFim在禾谷镰刀菌DON毒素生物合成中的作用
    3 讨论
    参考文献
第四章 全基因组测序表明myosin5的点突变导致禾谷镰刀菌对氰烯菌酯的抗性
    1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒、杀菌剂与培养基
        1.2 试剂
        1.3 分子生物学技术
        1.4 基因组重测序
            1.4.1 测序方法
            1.4.2 数据分析
        1.5 22个功能注释基因的克隆和测序
        1.6 Myosin-5的序列和结构域分析
        1.7 Myosin-5基因置换载体的构建
        1.8 转化子验证
        1.9 替代突变体的表型分析
            1.9.1 对氰烯菌酯敏感性测定
            1.9.2 菌丝生长速率分析及菌落形态观察
        1.10 表达量分析
        1.11 禾谷镰刀菌myosin-5马达结构域的同源建模
    2 结果与分析
        2.1 全基因组重测序的质量
        2.2 禾谷镰刀菌氰烯菌酯抗性菌株myosin-5点突变的鉴定
        2.3 禾谷镰刀菌氰烯菌酯敏感和抗性菌株myosin-5基因置换及药敏性验证
        2.4 Myosiin-5序列及结构域与药敏性的关系分析
        2.5 Myosin-5抗药性突变体菌落表型及菌丝生长速率
        2.6 禾谷镰刀菌myosin-5,myosin-2B和typeⅡ myosin表达量与药敏性分析
        2.7 禾谷镰刀菌myosin-5马达结构域同源建模及与氰烯菌酯分子对接的分值
    3 讨论
    参考文献
第五章 尖孢镰刀菌Myosin-5点突变对氰烯菌酯的抗药性研究
    1 材料与方法
        1.1 菌株、质粒、杀菌剂与培养基
        1.2 试剂
        1.3 分子生物学技术
            1.3.1 尖孢镰刀菌基因组DNA的提取
            1.3.2 常规PCR反应体系及程序
            1.3.3 Overlapping PCR反应体系及程序
        1.4 孢子和菌丝形态的显微观察
        1.5 氰烯菌酯敏感性测定
        1.6 同源的myosin5马达结构域的序列比对
        1.7 FoMyo5置换突变体的构建
        1.8 FoMyo5置换突变体的马达结构域测序验证
    2 结果与分析
        2.1 禾谷镰刀菌、亚洲镰刀菌和六个不同来源的尖孢镰刀菌菌株对氰烯菌酯的敏感性
        2.2 氰烯菌酯对尖孢镰刀菌无性繁殖的影响
        2.3 FoMyo5与FgMyo5马达结构域的同源性及与氰烯菌酯药敏性的相关性
        2.4 敏感菌株Fo32931和抗性菌株Fo47,Fol4287中FoMyo5的基因置换及对氰烯菌酯的敏感性
    3 讨论
    参考文献
第六章 RNA-seq分析亚洲镰刀菌对氰烯菌酯药理作用的响应调控机制研究
    1 材料与方法
        1.1 菌株、杀菌剂与培养基
        1.2 氰烯菌酯敏感和抗性突变体的构建
        1.3 对氰烯菌酯敏感性测定
        1.4 总RNA提取
        1.5 总RNA样品检测
        1.6 RNA-seq测序
            1.6.1 文库构建
            1.6.2 文库检测
            1.6.3 上机测序
        1.7 RNA-seq分析
            1.7.1 原始序列数据
            1.7.2 测序数据质量评估
            1.7.3 参考序列比对分析
            1.7.4 可变剪切分析
            1.7.5 新转录本预测
            1.7.6 SNP和InDel分析
            1.7.7 基因表达水平分析
            1.7.8 RNA-Seq相关性检查
            1.7.9 差异表达分析
            1.7.10 差异基因GO富集分析
            1.7.11 差异基因KEGG富集分析
    2 结果与分析
        2.1 氰烯菌酯敏感和抗性突变体的构建
        2.2 亚洲镰刀菌对氰烯菌酯敏感和抗性突变体的RNA-seq差异
        2.3 氰烯菌酯敏感和抗性突变体的基因表达差异(DEGs分析)
        2.4 DEG的基因簇聚类分析和功能富集
        2.5 DEG的GO的类别
        2.6 DEG的KEGG途径分析
        2.7 与细胞周期和DNA复制及ABC转运蛋白相关的代谢途径
        2.8 可变剪切分析
    3 讨论
    参考文献
结论
    一、本文获得的主要结果
    二、本文的主要创新点
    三、本文尚待解决的问题
附录
攻读博士学位期间发表的学术论文
致谢


【参考文献】：
期刊论文
[1]氰烯菌酯对禾谷镰孢菌分生孢子萌发及菌丝生长的影响[J]. 陈雨,张文芝,周明国.  农药学学报. 2007(03)
[2]禾谷镰孢菌对氰烯菌酯的敏感性基线及室内抗药性风险初步评估[J]. 李恒奎,陈长军,王建新,周明国.  植物病理学报. 2006(03)

博士论文
[1]新型杀菌剂氰烯菌酯对禾谷镰孢菌（Fusarium graminearum）的作用方式及抗药性遗传研究[D]. 陈雨.南京农业大学 2009



本文编号：3713231