蜕皮激素诱导棉铃虫血细胞外突的分子机制

发布时间：2022-12-17 17:55

　　细胞外突（cell protrusions）根据形状分为片状伪足、丝状伪足等,常见于细胞迁移和吞噬。在细胞迁移和吞噬过程中,细胞通过成核促进因子如WAVE、WASP等激活肌动蛋白成核复合物Arp2/3或formins,生成网状或丝状肌动蛋白并引起肌动蛋白聚合,以此提供细胞外突的力。研究发现,除了肌动蛋白聚合通路外,细胞外突还能够被网格蛋白重链（Clathrin heavy chain,CHC）抑制。网格蛋白在胞吞作用中研究较为广泛,但其在外突机制的研究比较少。有报道认为蜕皮激素（20-hydroxyecdysone,20E）能够促进昆虫免疫细胞的吞噬作用并加速血细胞运动,但其中的分子机制未知。棉铃虫（Helicoverpa armigera）是一种代表性的重要农业害虫,本论文研究以棉铃虫为材料,探究20E诱导细胞外突的分子机制。在本研究中,首先使用20E处理棉铃虫6龄早期幼虫,通过电镜对血细胞形态进行观察,发现20E处理后的血细胞产生外突,而未经20E处理的血细胞没有此现象。随后运用荧光显微镜观察,结果表明F-actin的表型与细胞形态一致,表现为向外突出,据此初步认为20E能够促进血... 

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摘要
ABSTRACT
第一章 引言
    1.1 细胞外突及其功能
        1.1.1 细胞外突
        1.1.2 细胞的吞噬与迁移
    1.2 肌动蛋白及其聚合的机制
    1.3 网格蛋白
        1.3.1 网格蛋白的结构与功能
        1.3.2 网格蛋白与细胞外突
    1.4 20E与细胞免疫
        1.4.1 昆虫的先天免疫
        1.4.2 昆虫蜕皮激素与先天免疫
    1.5 研究现状与意义
第二章 材料与方法
    2.1 实验材料
        2.1.1 实验虫体及饲养
        2.1.2 实验所用试剂
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 试剂配方
    2.2 实验方法
        2.2.1 棉铃虫血细胞RNA的提取
        2.2.2 以RNA为模板合成第一链c DNA
        2.2.3 引物设计与合成
        2.2.4 PCR扩增
        2.2.5 PCR产物回收
        2.2.6 载体质粒的提取
        2.2.7 构建重组载体
        2.2.8 重组质粒的诱导表达
        2.2.9 蛋白纯化(包涵体)
        2.2.10 弗氏佐剂的包埋
        2.2.11 dsRNA的合成与纯化
        2.2.12 细胞培养
        2.2.13 细胞的转染
        2.2.15 棉铃虫血细胞的蛋白提取
        2.2.16 Western blot
        2.2.17 免疫共沉淀
        2.2.18 电镜制片
        2.2.19 免疫组化
第三章 实验结果
    3.1 20E诱导棉铃虫血细胞外突的电镜观察
    3.2 下调CHC及 CLC对血细胞形态的影响
    3.3 棉铃虫CHC、CLC、Arp2/3 抗体的制备
        3.3.1 CHC、CLC、Arp2/3 的获取
        3.3.2 CHC、CLC、Arp2/3 的表达与纯化
        3.3.3 CHC、CLC、Arp2/3 的抗体验证
    3.4 CHC、CLC、Arp2/3 的蛋白表达模式
    3.5 20E诱导网格蛋白的表达
    3.6 20E诱导下CLC与 Arp2/3 的相互作用
    3.7 CLC与 Arp2/3 的亚细胞定位
第四章 讨论与总结
参考文献
致谢



本文编号：3720381