OsHIN1负调控水稻抗白叶枯病的机理初探

发布时间：2023-03-11 00:16

　　水稻白叶枯病是一种世界性水稻细菌性病害,对水稻生产以及粮食的安全都造成了严重危害,因此对水稻抗病相关机制的研究尤为重要。本实验室前期已证明了OsmiR1858a超表达株系显著提高了对白叶枯病的抗性,它的剪切靶基因为OsHIN1(Harpin-induced 1 domain containing protein),超表达OsHIN1的水稻植株减弱了对白叶枯的抗性,而RNAi和敲除突变体则正好相反。这些结果证明OsHIN1负调控水稻对白叶枯病的抗性,但机制不详。因此,对OsHIN1负调控水稻抗白叶枯病的机制进行探索非常必要。OsHIN1为未知功能蛋白,为了明确它可能的作用网络,拟通过鉴定OsHIN1表达特点、亚细胞定位与鉴定它的互作蛋白,为阐明OsHIN1负调控水稻白叶枯病中的机制提供线索。主要研究结果如下:(1)克隆2kb OsHIN1启动子,构建了pOsHIN1::GUS表达载体并遗传转化水稻,经PCR检测筛选获得12株独立转基因株系(已经获得T1代种子)。对转基因水稻GUS染色结果表明,GUS在水稻幼嫩部位表达较多,成熟部位较少;在叶节点、根茎结合部、根毛等分生组织旺盛部位发现强的...

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【学位级别】：硕士

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摘要
Abstract
缩写说明
第一章 文献综述
    1 水稻白叶枯病概述
    2 水稻白叶枯病抗性基因研究进展
        2.1 水稻抗白叶枯病主效基因研究进展
            2.1.1 NBS-LRR类
            2.1.2 LRR-RLK类
            2.1.3 细胞壁相关激酶类
            2.1.4 隐性基因类
            2.1.5 Executor R基因类
        2.2 水稻感白叶枯病主效基因研究进展
            2.2.1 OsSWEET11和OsSWEET13
            2.2.2 OsSWEET14
            2.2.3 OsSWEET12和OsSWEET15
        2.3 水稻抗白叶枯病微效基因研究进展
            2.3.1 WRKY转录因子类
            2.3.2 MAPK基因家族
            2.3.3 免疫反应相关类
            2.3.4 miRNA
    3 水稻感白叶枯病机理研究
    4 水稻抗白叶枯病资源挖掘策略
    5 鉴定互作蛋白对抗病机理研究的作用
    6 研究意义及技术路线
        6.1 研究目的及意义
        6.2 技术路线
第二章 OsHIN1的器官表达
    1 前言
    2 材料与试剂
        2.1 实验材料
        2.2 试剂与菌株
    3 实验方法
        3.1 pOsHIN1::GUS载体的构建
            3.1.1 引物的设计
            3.1.2 目的片段的扩增
            3.1.3 载体的酶切
            3.1.4 目的片段及载体回收
            3.1.5 连接与转化
            3.1.6 载体的验证与保存
        3.2 农杆菌EHA105的转化
            3.2.1 农杆菌EHA105感受态细胞的制备
            3.2.2 表达载体农杆菌转化
            3.2.3 转化农杆菌的鉴定及菌液保存
        3.3 水稻遗传转化
            3.3.1 水稻愈伤组织的诱导
            3.3.2 愈伤组织的继代
            3.3.3 农杆菌培养
            3.3.4 愈伤组织的侵染和共培养
            3.3.5 脱菌和筛选
            3.3.6 分化
            3.3.7 生根及炼苗
        3.4 pOsHIN1::GUS转基因苗的验证
            3.4.1 基因组DNA的提取
            3.4.2 PCR验证
        3.5 GUS染色
            3.5.1 水稻白叶枯菌P6的培养
            3.5.2 水稻白叶枯菌的接种
            3.5.3 GUS染色
    4 结果与分析
        4.1 pOsHIN1::GUS的载体构建
        4.2 pOsHIN1::GUS遗传转化
        4.3 GUS染色
    5 讨论
第三章 OsHIN1的亚细胞定位
    1 前言
    2 材料与试剂
    3 实验方法
        3.1 高纯度质粒提取
        3.2 水稻原生质体的制备及转化
    4 结果分析
    5 讨论
第四章 OsHIN1互作蛋白的筛选
    1 前言
    2 材料与试剂
        2.1 材料
        2.2 试剂和菌株
    3 实验方法
        3.1 35S::eGFP(ATG)和35S::OsHIN1:eGFP载体的构建
            3.1.1 引物的设计
            3.1.2 目的片段的扩增
            3.1.3 载体的酶切
            3.1.4 目的片段及载体回收
            3.1.5 连接与转化
            3.1.6 载体的验证与保存
        3.2 农杆菌EHα105的转化
        3.3 水稻遗传转化
        3.4 35S::eGFP和35S::OsHIN1:eGFP转基因苗的验证
        3.5 酵母双杂交cDNA文库的构建及筛选
            3.5.1 水稻幼苗的培养
            3.5.2 水稻白叶枯菌P6的培养
            3.5.3 水稻白叶枯菌P6的接种
            3.5.4 样品的取送
    4 结果与分析
        4.1 载体构建结果
        4.2 遗传转化结果
        4.3 酵母筛库结果
    5 讨论
第五章 OsHIN1互作蛋白的鉴定
    1 前言
    2 实验材料
        2.1 试剂与菌株
        2.2 材料与载体
    3 实验方法
        3.1 片段式酵母点对点验证
        3.2 互作蛋白各基因CDS序列的克隆
            3.2.1 水稻总RNA的提取
            3.2.2 cDNA一链的合成
            3.2.3 基因序列的克隆
        3.3 双分子荧光互补载体构建
        3.4 酵母双杂交载体构建
        3.5 双分子荧光互补验证
            3.5.1 BiFC载体转化农杆菌GV3101
            3.5.2 烟草注射
        3.6 酵母双杂交(全长)验证
            3.6.1 载体的自激活验证
            3.6.2 酵母双杂交(全长)一对一验证
    4 结果与分析
        4.1 片段式酵母点对点验证
        4.2 互作蛋白基因CDS序列克隆
        4.3 双分子荧光互补载体构建
        4.4 酵母双杂交载体构建
        4.5 双分子荧光互补验证
        4.6 酵母双杂交验证
            4.6.1 载体的自激活验证
            4.6.2 酵母双杂交(全长)一对一验证
    5 讨论
第六章 结论与展望
    1 研究结论
    2 研究展望
参考文献
附录
致谢



本文编号：3758829