枯草芽胞杆菌9407生防机制研究
发布时间：2023-04-04 05:51
枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis),己成功应用于多种植物病害的防治,是生防微生物的重要组成部分。B.subtilis 9407是本实验室从苹果上分离获得的有益芽胞杆菌,对苹果轮纹病具有明显的防治效果,应用前景广阔。本研究利用分析化学和分子生物学技术,探究了该菌株抑制苹果轮纹病菌(Botryosphaeriadothidea)和瓜类细菌性果斑病菌Acidovorax citrulli)的主要抑菌物质及其在生物防治中的作用、MecA在定殖和细菌性果斑病生物防治中的作用、MecA调控生物膜形成的途径,不仅有利于揭示生防芽胞杆菌的防病机制,而且有助于探寻提高生防菌生防效果的新途径。1.B.subtilis9407抑菌物质fengycin对苹果轮纹病生物防治作用。为深入研究该菌株的主要抑菌物质及生防机制,本研究筛选了 14,300株随机插入突变体,获得34株对B.dothiddea抑菌能力发生显著变化的突变体。通过Southern blot、反向PCR和测序分析确定突变体Q4-33(抑菌能力显著降低)中,转座子插入位点为基因ppsB。本研究构建ppsB缺失突变体△ppsB。抑菌活...
【文章页数】：174 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 绪论
1.1 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用
1.1.1 枯草芽胞杆菌
1.1.2 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用
1.1.3 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中存在的问题及对策
1.2 枯草芽胞杆菌的生防作用机制
1.2.1 拮抗作用
1.2.2 竞争作用
1.2.3 溶菌作用
1.2.4 诱导抗病性
1.3 枯草芽胞杆菌脂肽类抗生素研究进展
1.3.1 脂肽类抗生素的分类及结构
1.3.2 脂肽类抗生素的生物合成机制及调控途径
1.3.3 脂肽类抗生素的生物学功能
1.4 枯草芽胞杆菌生物膜研究进展
1.4.1 枯草芽胞杆菌生物膜生活史
1.4.2 枯草芽胞杆菌生物膜形态和结构组分
1.4.3 枯草芽胞杆菌生物膜形成过程中基因调控网络
1.4.4 枯草芽胞杆菌生物膜形的起始
1.4.5 枯草芽胞杆菌生物膜形的成熟与消解
1.4.6 枯草芽胞杆菌生物膜在生物防治中的作用
1.5 研究内容及目的意义
1.5.1 研究内容
1.5.2 研究目的与意义
第二章 B.subtilis 9407抑菌物质fengycin对苹果轮纹病生物防治作用研究
2.1 实验材料
2.1.1 苹果
2.1.2 菌株、质粒及培养条件
2.1.3 酶和引物合成
2.1.4 培养基及实验溶液的配制
2.1.5 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
2.2.3 B.subtilis 9407菌株感受态细胞的制备及电击转化
2.2.4 B.subtilis菌株基因组DNA的提取
2.2.5 PCR扩增产物的纯化
2.2.6 PCR扩增产物胶回收
2.2.7 苹果轮纹病菌孢子悬液的制备
2.2.8 转座子突变体库的筛选
2.2.9 Southern blot
2.2.10 反向PCR和序列分析
2.2.11 缺失重组载体的构建
2.2.12 目标基因缺失突变体的构建及筛选
2.2.13 目标基因缺失突变体的抑菌活性测定
2.2.14 脂肽类抗生素粗提物的制备
2.2.15 脂肽类抗生素粗提物的抑菌活性检测
2.2.16 薄层层析-生物自显影(thin-layer chromatography Bioutography)
2.2.17 RP-HPLC分析
2.2.18 苹果果实上的生防效果测定
2.3 结果与分析
2.3.1 对苹果轮纹病菌抑菌能力发生变化突变体的筛选
2.3.2 转座子插入位点基因的鉴定和分析
2.3.3 ppsB缺失突变体的构建
2.3.4 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物对B.dothidea的抑制作用分析
2.3.5 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物薄层层析-生物自显影分析
2.3.6 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物高效液相色谱分析
2.3.7 B.subtilis 9407和△ppsB对苹果果实上轮纹病的生防效果
2.4 小结
2.5 讨论
第三章 B.subtilis 9407抑菌物质surfactin对瓜类细菌性果斑病生物防治作用研究
3.1 实验材料
3.1.1 菌株、质粒及培养条件
3.1.2 酶和引物合成
3.1.3 培养基及实验溶液的配制
3.1.4 主要实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
3.2.3 B.subtilis 9407菌株感受态细胞的制备及电击转化
3.2.4 B.subtilis菌株基因组DNA的提取
3.2.5 PCR扩增产物的纯化
3.2.6 PCR扩增产物胶回收
3.2.7 srfAB突变载体pMAD-srfAB的构建
3.2.8 △srfAB的构建及验证
3.2.9 脂肽粗提物的制备
3.2.10 RP-HPLC分析
3.2.11 B.subtilis 9407拮抗活性测定
3.2.12 温室条件下对细菌性果斑病菌生防效果的测定
3.2.13 生物膜形成能力检测
3.2.14 运动性检测
3.2.15 B.subtilis 9407、△srfAB标记菌株的构建
3.2.16 生长曲线的测定
3.2.17 B.subtilis 9407、△srfAB在甜瓜根部和叶部定殖能力测定
3.3 结果与分析
3.3.1 B.subtilis 9407拮抗性的测定
3.3.2 B.subtilis 9407对瓜类细菌性果斑病的生防效果测定
3.3.3 △srfAB的构建
3.3.4 B.subtilis 9407、△srfAB生长曲线测定
3.3.5 B.subtilis 9407、△srfAB脂肽粗提物高效液相色谱分析
3.3.6 B.subtilis 9407、△ppsB、△srfAB抑菌能力的测定
3.3.7 B.subtilis 9407、△srfAB的生物膜形成能力
3.3.8 B.subtilis 9407、△srfAB的运动性
3.3.9 B.subtilis 9407、△srfAB标记菌株的构建
3.3.10 B.subtilis 9407(pC-1)和△srfAB(pC-1)生长曲线测定
3.3.11 B.subtilis 9407(pC-1)、△srfAB(pC-1)在甜瓜根内部和叶内部的定殖能力
3.3.12 B.subtilis 9407、△srfAB对甜瓜果斑病的生物防治效果测定
3.4 小结
3.5 讨论
第四章 B.subtilis 9407 MecA对定殖和细菌性果斑病生物防治的作用
4.1 实验材料
4.1.1 菌株、质粒及培养条件
4.1.2 酶和引物合成
4.1.3 培养基及实验溶液的配制
4.1.4 主要实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
4.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
4.2.3 B.subtilis 9407菌株感受态细胞的制备及电击转化
4.2.4 B.subtilis菌株基因组DNA的提取
4.2.5 PCR扩增产物的纯化
4.2.6 PCR扩增产物胶回收
4.2.7 生物膜形成能力发生变化突变体筛选
4.2.8 Southern blot
4.2.9 反向PCR和序列分析
4.2.10 缺失重组载体pMDE-mecA的构建
4.2.11 mecA缺失突变体的构建及筛选验证
4.2.12 功能互补载体的构建
4.2.13 互补菌株的构建
4.2.14 生长曲线的测定
4.2.15 生物膜形成能力检测
4.2.16 运动性检测
4.2.17 B.subtilis 9407、△mecA对细菌性果斑病的抑菌能力测定
4.2.18 B.subtilis 9407、△mecA在甜瓜根部和叶部定殖能力测定
4.2.19 温室条件下B.subtilis 9407、△mecA对细菌性果斑病菌生防效果的测定
4.3 结果与分析
4.3.1 B.subtilis 9407生物膜形成能力降低突变体的筛选
4.3.2 转座子插入位点基因的鉴定和分析
4.3.3 随机插入突变体的生长曲线测定
4.3.4 mecA缺失突变体和互补菌株的构建
4.3.5 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)菌株生长曲线的测定
4.3.6 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)生物膜形成能力检测
4.3.7 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)的运动性检测
4.3.8 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)在甜瓜根部和叶部的定殖能力
4.3.9 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)抑菌活性的分析
4.3.10 9407(pBE2)、AmecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)对甜瓜果斑病的生物防治
4.4 小结
4.5 讨论
第五章 B.subtilis 9407 MecA对生物膜形成调控途径的分析
5.1 实验材料
5.1.1 菌株、质粒及培养条件
5.1.2 酶和引物合成
5.1.3 培养基及实验溶液的配制
5.1.4 主要实验仪器
5.2 实验方法
5.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
5.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
5.2.3 B.subtilis 9407菌株感受态细胞的制备及电击转化
5.2.4 B.subtilis菌株基因组DNA的提取
5.2.5 PCR扩增产物的纯化
5.2.6 PCR扩增产物胶回收
5.2.7 缺失重组载体的构建
5.2.8 缺失突变体的构建及筛选验证
5.2.9 功能互补载体的构建
5.2.10 功能互补菌株的构建
5.2.11 生物膜形成能力检测
5.2.12 promoter-lacZ同源重组质粒的构建
5.2.13 promoter-lacZ融合菌株的构建
5.2.14 β-半乳糖苷酶活性的测定
5.3 结果与分析
5.3.1 MecA影响B.subtilis 9407生物膜基质主要组分基因的表达
5.3.2 MecA通过SpoOA-SinI-SinR途径调控B.subtilis 9407生物膜形成
5.3.3 MecA通过AbrB调控B.subtilis 9407生物膜形成
5.3.4 MecA通过SinR调控B.subtilis 9407生物膜形成
5.3.5 MecA及生物膜形成关键因子的序列分析
5.4 小结
5.5 讨论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 本研究的创新性
6.3 展望
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3781906
【文章页数】：174 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略语表
第一章 绪论
1.1 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用
1.1.1 枯草芽胞杆菌
1.1.2 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中的应用
1.1.3 枯草芽胞杆菌在植物病害生物防治中存在的问题及对策
1.2 枯草芽胞杆菌的生防作用机制
1.2.1 拮抗作用
1.2.2 竞争作用
1.2.3 溶菌作用
1.2.4 诱导抗病性
1.3 枯草芽胞杆菌脂肽类抗生素研究进展
1.3.1 脂肽类抗生素的分类及结构
1.3.2 脂肽类抗生素的生物合成机制及调控途径
1.3.3 脂肽类抗生素的生物学功能
1.4 枯草芽胞杆菌生物膜研究进展
1.4.1 枯草芽胞杆菌生物膜生活史
1.4.2 枯草芽胞杆菌生物膜形态和结构组分
1.4.3 枯草芽胞杆菌生物膜形成过程中基因调控网络
1.4.4 枯草芽胞杆菌生物膜形的起始
1.4.5 枯草芽胞杆菌生物膜形的成熟与消解
1.4.6 枯草芽胞杆菌生物膜在生物防治中的作用
1.5 研究内容及目的意义
1.5.1 研究内容
1.5.2 研究目的与意义
第二章 B.subtilis 9407抑菌物质fengycin对苹果轮纹病生物防治作用研究
2.1 实验材料
2.1.1 苹果
2.1.2 菌株、质粒及培养条件
2.1.3 酶和引物合成
2.1.4 培养基及实验溶液的配制
2.1.5 主要实验仪器
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
2.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
2.2.3 B.subtilis 9407菌株感受态细胞的制备及电击转化
2.2.4 B.subtilis菌株基因组DNA的提取
2.2.5 PCR扩增产物的纯化
2.2.6 PCR扩增产物胶回收
2.2.7 苹果轮纹病菌孢子悬液的制备
2.2.8 转座子突变体库的筛选
2.2.9 Southern blot
2.2.10 反向PCR和序列分析
2.2.11 缺失重组载体的构建
2.2.12 目标基因缺失突变体的构建及筛选
2.2.13 目标基因缺失突变体的抑菌活性测定
2.2.14 脂肽类抗生素粗提物的制备
2.2.15 脂肽类抗生素粗提物的抑菌活性检测
2.2.16 薄层层析-生物自显影(thin-layer chromatography Bioutography)
2.2.17 RP-HPLC分析
2.2.18 苹果果实上的生防效果测定
2.3 结果与分析
2.3.1 对苹果轮纹病菌抑菌能力发生变化突变体的筛选
2.3.2 转座子插入位点基因的鉴定和分析
2.3.3 ppsB缺失突变体的构建
2.3.4 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物对B.dothidea的抑制作用分析
2.3.5 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物薄层层析-生物自显影分析
2.3.6 B.subtilis 9407和△ppsB脂肽粗提物高效液相色谱分析
2.3.7 B.subtilis 9407和△ppsB对苹果果实上轮纹病的生防效果
2.4 小结
2.5 讨论
第三章 B.subtilis 9407抑菌物质surfactin对瓜类细菌性果斑病生物防治作用研究
3.1 实验材料
3.1.1 菌株、质粒及培养条件
3.1.2 酶和引物合成
3.1.3 培养基及实验溶液的配制
3.1.4 主要实验仪器
3.2 实验方法
3.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
3.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
3.2.3 B.subtilis 9407菌株感受态细胞的制备及电击转化
3.2.4 B.subtilis菌株基因组DNA的提取
3.2.5 PCR扩增产物的纯化
3.2.6 PCR扩增产物胶回收
3.2.7 srfAB突变载体pMAD-srfAB的构建
3.2.8 △srfAB的构建及验证
3.2.9 脂肽粗提物的制备
3.2.10 RP-HPLC分析
3.2.11 B.subtilis 9407拮抗活性测定
3.2.12 温室条件下对细菌性果斑病菌生防效果的测定
3.2.13 生物膜形成能力检测
3.2.14 运动性检测
3.2.15 B.subtilis 9407、△srfAB标记菌株的构建
3.2.16 生长曲线的测定
3.2.17 B.subtilis 9407、△srfAB在甜瓜根部和叶部定殖能力测定
3.3 结果与分析
3.3.1 B.subtilis 9407拮抗性的测定
3.3.2 B.subtilis 9407对瓜类细菌性果斑病的生防效果测定
3.3.3 △srfAB的构建
3.3.4 B.subtilis 9407、△srfAB生长曲线测定
3.3.5 B.subtilis 9407、△srfAB脂肽粗提物高效液相色谱分析
3.3.6 B.subtilis 9407、△ppsB、△srfAB抑菌能力的测定
3.3.7 B.subtilis 9407、△srfAB的生物膜形成能力
3.3.8 B.subtilis 9407、△srfAB的运动性
3.3.9 B.subtilis 9407、△srfAB标记菌株的构建
3.3.10 B.subtilis 9407(pC-1)和△srfAB(pC-1)生长曲线测定
3.3.11 B.subtilis 9407(pC-1)、△srfAB(pC-1)在甜瓜根内部和叶内部的定殖能力
3.3.12 B.subtilis 9407、△srfAB对甜瓜果斑病的生物防治效果测定
3.4 小结
3.5 讨论
第四章 B.subtilis 9407 MecA对定殖和细菌性果斑病生物防治的作用
4.1 实验材料
4.1.1 菌株、质粒及培养条件
4.1.2 酶和引物合成
4.1.3 培养基及实验溶液的配制
4.1.4 主要实验仪器
4.2 实验方法
4.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
4.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
4.2.3 B.subtilis 9407菌株感受态细胞的制备及电击转化
4.2.4 B.subtilis菌株基因组DNA的提取
4.2.5 PCR扩增产物的纯化
4.2.6 PCR扩增产物胶回收
4.2.7 生物膜形成能力发生变化突变体筛选
4.2.8 Southern blot
4.2.9 反向PCR和序列分析
4.2.10 缺失重组载体pMDE-mecA的构建
4.2.11 mecA缺失突变体的构建及筛选验证
4.2.12 功能互补载体的构建
4.2.13 互补菌株的构建
4.2.14 生长曲线的测定
4.2.15 生物膜形成能力检测
4.2.16 运动性检测
4.2.17 B.subtilis 9407、△mecA对细菌性果斑病的抑菌能力测定
4.2.18 B.subtilis 9407、△mecA在甜瓜根部和叶部定殖能力测定
4.2.19 温室条件下B.subtilis 9407、△mecA对细菌性果斑病菌生防效果的测定
4.3 结果与分析
4.3.1 B.subtilis 9407生物膜形成能力降低突变体的筛选
4.3.2 转座子插入位点基因的鉴定和分析
4.3.3 随机插入突变体的生长曲线测定
4.3.4 mecA缺失突变体和互补菌株的构建
4.3.5 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)菌株生长曲线的测定
4.3.6 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)生物膜形成能力检测
4.3.7 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)的运动性检测
4.3.8 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)在甜瓜根部和叶部的定殖能力
4.3.9 9407(pBE2)、△mecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)抑菌活性的分析
4.3.10 9407(pBE2)、AmecA(pBE2)、△mecA(pBE2A)对甜瓜果斑病的生物防治
4.4 小结
4.5 讨论
第五章 B.subtilis 9407 MecA对生物膜形成调控途径的分析
5.1 实验材料
5.1.1 菌株、质粒及培养条件
5.1.2 酶和引物合成
5.1.3 培养基及实验溶液的配制
5.1.4 主要实验仪器
5.2 实验方法
5.2.1 大肠杆菌感受态细胞的制备
5.2.2 大肠杆菌质粒DNA的提取
5.2.3 B.subtilis 9407菌株感受态细胞的制备及电击转化
5.2.4 B.subtilis菌株基因组DNA的提取
5.2.5 PCR扩增产物的纯化
5.2.6 PCR扩增产物胶回收
5.2.7 缺失重组载体的构建
5.2.8 缺失突变体的构建及筛选验证
5.2.9 功能互补载体的构建
5.2.10 功能互补菌株的构建
5.2.11 生物膜形成能力检测
5.2.12 promoter-lacZ同源重组质粒的构建
5.2.13 promoter-lacZ融合菌株的构建
5.2.14 β-半乳糖苷酶活性的测定
5.3 结果与分析
5.3.1 MecA影响B.subtilis 9407生物膜基质主要组分基因的表达
5.3.2 MecA通过SpoOA-SinI-SinR途径调控B.subtilis 9407生物膜形成
5.3.3 MecA通过AbrB调控B.subtilis 9407生物膜形成
5.3.4 MecA通过SinR调控B.subtilis 9407生物膜形成
5.3.5 MecA及生物膜形成关键因子的序列分析
5.4 小结
5.5 讨论
第六章 结论与展望
6.1 结论
6.2 本研究的创新性
6.3 展望
参考文献
致谢
作者简介
本文编号：3781906
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