苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白对鳞翅目害虫协同增效机制的研究
发布时间：2023-04-08 19:17
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis,Bt)可以产生多种杀虫蛋白,如营养期的Vip蛋白和芽胞期形成的Cry晶体蛋白。由于Bt杀虫蛋白对鳞翅目、鞘翅目和双翅目等多种害虫具有特异的杀虫效果,因此被广泛用于转基因作物中。然而在转Bt作物的广泛种植过程中,其显著的抗虫效果被靶标昆虫所产生的抗性日益削减。而两种或多种Bt蛋白组合不仅能有效克服或延缓靶标害虫对Bt蛋白抗性的产生,而且能扩大杀虫谱;其中,特定的蛋白组合还能产生协同增效作用,显著提高杀虫活性。在前期研究中发现Cry9Aa和Vip3Aa蛋白组合对水稻二化螟(Chilo suppressalis)具有显著的协同增效杀虫效果。但迄今为止全世界范围内关于Cry和Vip蛋白之间的增效作用机制的研究仍为空白。本研究首先对Cry9Aa和Vip3Aa蛋白对水稻二化螟的协同增效杀虫机制进行了深入的研究,在此基础上,开展了对玉米害虫高效的Bt蛋白组合筛选,主要进展如下:1.证明了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV存在特异性结合;明确了Cry9Aa和Vip3Aa蛋白在BBMV上存在不同的受体结合位点。2.发现了Cry9Aa和V...
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 苏云金芽胞杆菌Cry蛋白
1.1.1 3d-Cry蛋白的结构
1.1.2 3d-Cry蛋白对靶标害虫的杀虫作用机制
1.1.3 其它Cry蛋白
1.2 苏云金芽胞杆菌Vip蛋白
1.2.1 Vip3蛋白的结构
1.2.2 Vip3蛋白杀虫作用机制
1.2.3 其它Vip蛋白
1.3 协同增效杀虫作用机制
1.3.1 Cry和Vip蛋白之间的增效作用
1.3.2 Cry和Cyt蛋白的增效作用
1.3.3 Cry蛋白和受体钙粘蛋白的增效作用
1.3.4 Cry蛋白之间的增效作用
1.3.5 Cry蛋白和其它物质的增效作用
1.4 昆虫对苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的抗性机制
1.5 本研究涉及的主要鳞翅目害虫
1.5.1 水稻二化螟
1.5.2 亚洲玉米螟
1.5.3 东方粘虫
1.6 本研究涉及的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白
1.6.1 Cry9Aa和Cry9Ee蛋白
1.6.2 Vip3Aa蛋白
1.6.3 Cry1Bb蛋白
1.7 研究目的、意义和立题依据
1.8 主要研究内容
1.8.1 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白组合在水稻二化螟BBMV上的结合分析
1.8.2 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的结合分析
1.8.3 Cry9Aa与Vip3Aa蛋白结合位点的确定
1.8.4 对两种玉米害虫具有协同增效杀虫活性的Bt蛋白组合筛选
1.8.5 亚洲玉米螟对Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的交互抗性机制分析
第二章 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV的结合以及两蛋白间的结合分析
2.1 实验材料
2.1.1 菌株信息
2.1.2 供试昆虫
2.1.3 实验试剂与耗材
2.1.4 培养基与抗生素
2.1.5 常用溶液与缓冲液
2.1.6 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 蛋白的提取
2.2.2 蛋白的亲和纯化
2.2.3 蛋白的活化
2.2.4 蛋白的凝胶过滤纯化
2.2.5 Bradford法测定蛋白浓度
2.2.6 蛋白的生物素标记
2.2.7 BBMV的提取
2.2.8 APN酶活测定
2.2.9 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的饱和结合实验
2.2.10 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的同源竞争结合实验
2.2.11 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的异源竞争结合实验
2.2.12 Ligand-blot实验
2.2.13 ELISA实验
2.3 结果与分析
2.3.1 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的提取与纯化
2.3.2 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的活化
2.3.3 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的凝胶过滤纯化
2.3.4 Western-blot检测Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的生物素标记情况
2.3.5 BBMV的提取与APN酶活测定
2.3.6 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV饱和结合情况
2.3.7 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV同源竞争结合情况
2.3.8 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV异源竞争结合情况
2.3.9 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的Ligand-blot结合分析
2.3.10 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的ELISA结合分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 Cry9Aa蛋白协同增效关键位点的确定
3.1 实验材料
3.1.1 菌株与质粒
3.1.2 引物
3.1.3 供试昆虫
3.1.4 实验试剂与耗材
3.1.5 常用溶液与缓冲液
3.1.6 主要仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 结构预测与序列比对分析
3.2.2 PCR克隆Cry9Aa各结构域片段
3.2.3 DNA片段双酶切及纯化
3.2.4 连接反应
3.2.5 电击转化
3.2.6 阳性克隆的鉴定
3.2.7 热激转化
3.2.8 合成多肽的结合分析
3.2.9 Cry9Aa突变体的构建
3.2.10 Cry9Aa突变体蛋白提取、纯化与定量
3.2.11 水稻二化螟杀虫活性测定
3.2.12 增效因子的计算
3.3 实验结果与分析
3.3.1 Cry9Aa蛋白的结构与疏水性分析
3.3.2 Cry9Aa蛋白结构域的分段表达
3.3.3 Cry9Aa各结构域片段与Vip3Aa蛋白的结合分析
3.3.4 Cry9Aa的loop突变体与Vip3Aa蛋白的结合分析
3.3.5 Cry9Aa合成肽段与Vip3Aa蛋白的结合情况分析
3.3.6 Cry9Aa参与结合的表位分析
3.3.7 Cry9Aa突变体的构建与表达
3.3.8 Cry9Aa突变体与Vip3Aa蛋白的结合分析
3.3.9 水稻二化螟杀虫活性测定
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 Vip3Aa蛋白协同增效关键位点的确定
4.1 实验材料
4.1.1 质粒信息
4.1.2 引物
4.1.3 供试昆虫
4.1.4 实验试剂与仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 Vip3Aa蛋白二级结构的预测
4.3 实验结果与分析
4.3.0 Vip3Aa蛋白重叠片段的构建与表达
4.3.1 Vip3Aa重叠片段与Cry9Aa蛋白的结合情况分析
4.3.2 Vip3Aa合成多肽与Cry9Aa蛋白的结合分析
4.3.3 Vip3Aa蛋白突变体的构建与表达
4.3.4 Vip3Aa突变体与Cry9Aa蛋白的结合分析
4.3.5 Vip3Aa蛋白二级结构的模拟
4.3.6 水稻二化螟的杀虫活性测定
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 对玉米害虫协同增效Bt杀虫蛋白组合的筛选
5.1 实验材料
5.1.1 菌株与质粒
5.1.2 引物
5.1.3 供试昆虫
5.1.4 实验试剂
5.1.5 常用溶液与缓冲液
5.2 实验方法
5.2.1 Bt杀虫基因的克隆
5.2.2 DNA片段双酶切及纯化
5.2.3 连接反应
5.2.4 热激转化
5.2.5 阳性克隆的鉴定
5.2.6 HD73-无晶体突变株感受态制备
5.2.7 电击转化
5.2.8 晶体形态观察
5.2.9 亚洲玉米螟和东方粘虫杀虫活性测定
5.3 实验结果与分析
5.3.1 Cry9Ee蛋白表达载体的构建
5.3.2 Cry9Ee蛋白在Bt中的表达
5.3.3 Cry9Ee蛋白的提取
5.3.4 Cry1Bb蛋白的载体构建与表达
5.3.5 Cry1Bb蛋白Ni亲和纯化
5.3.6 Cry1Ah和Cry1Ie蛋白的提取与纯化
5.3.7 亚洲玉米螟及东方粘虫杀虫活性测定
5.3.8 亚洲玉米螟BBMV的提取和定量
5.3.9 Cry9Ee与Cry1Ab在BBMV上的竞争结合实验
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3786327
【文章页数】：108 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
第一章 引言
1.1 苏云金芽胞杆菌Cry蛋白
1.1.1 3d-Cry蛋白的结构
1.1.2 3d-Cry蛋白对靶标害虫的杀虫作用机制
1.1.3 其它Cry蛋白
1.2 苏云金芽胞杆菌Vip蛋白
1.2.1 Vip3蛋白的结构
1.2.2 Vip3蛋白杀虫作用机制
1.2.3 其它Vip蛋白
1.3 协同增效杀虫作用机制
1.3.1 Cry和Vip蛋白之间的增效作用
1.3.2 Cry和Cyt蛋白的增效作用
1.3.3 Cry蛋白和受体钙粘蛋白的增效作用
1.3.4 Cry蛋白之间的增效作用
1.3.5 Cry蛋白和其它物质的增效作用
1.4 昆虫对苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白的抗性机制
1.5 本研究涉及的主要鳞翅目害虫
1.5.1 水稻二化螟
1.5.2 亚洲玉米螟
1.5.3 东方粘虫
1.6 本研究涉及的苏云金芽胞杆菌杀虫蛋白
1.6.1 Cry9Aa和Cry9Ee蛋白
1.6.2 Vip3Aa蛋白
1.6.3 Cry1Bb蛋白
1.7 研究目的、意义和立题依据
1.8 主要研究内容
1.8.1 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白组合在水稻二化螟BBMV上的结合分析
1.8.2 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的结合分析
1.8.3 Cry9Aa与Vip3Aa蛋白结合位点的确定
1.8.4 对两种玉米害虫具有协同增效杀虫活性的Bt蛋白组合筛选
1.8.5 亚洲玉米螟对Cry9Ee和Cry1Ab蛋白的交互抗性机制分析
第二章 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV的结合以及两蛋白间的结合分析
2.1 实验材料
2.1.1 菌株信息
2.1.2 供试昆虫
2.1.3 实验试剂与耗材
2.1.4 培养基与抗生素
2.1.5 常用溶液与缓冲液
2.1.6 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 蛋白的提取
2.2.2 蛋白的亲和纯化
2.2.3 蛋白的活化
2.2.4 蛋白的凝胶过滤纯化
2.2.5 Bradford法测定蛋白浓度
2.2.6 蛋白的生物素标记
2.2.7 BBMV的提取
2.2.8 APN酶活测定
2.2.9 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的饱和结合实验
2.2.10 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的同源竞争结合实验
2.2.11 Cry9Aa(或Vip3Aa)与BBMV的异源竞争结合实验
2.2.12 Ligand-blot实验
2.2.13 ELISA实验
2.3 结果与分析
2.3.1 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的提取与纯化
2.3.2 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的活化
2.3.3 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的凝胶过滤纯化
2.3.4 Western-blot检测Cry9Aa和Vip3Aa蛋白的生物素标记情况
2.3.5 BBMV的提取与APN酶活测定
2.3.6 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV饱和结合情况
2.3.7 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV同源竞争结合情况
2.3.8 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白与BBMV异源竞争结合情况
2.3.9 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的Ligand-blot结合分析
2.3.10 Cry9Aa和Vip3Aa蛋白之间的ELISA结合分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 Cry9Aa蛋白协同增效关键位点的确定
3.1 实验材料
3.1.1 菌株与质粒
3.1.2 引物
3.1.3 供试昆虫
3.1.4 实验试剂与耗材
3.1.5 常用溶液与缓冲液
3.1.6 主要仪器设备
3.2 实验方法
3.2.1 结构预测与序列比对分析
3.2.2 PCR克隆Cry9Aa各结构域片段
3.2.3 DNA片段双酶切及纯化
3.2.4 连接反应
3.2.5 电击转化
3.2.6 阳性克隆的鉴定
3.2.7 热激转化
3.2.8 合成多肽的结合分析
3.2.9 Cry9Aa突变体的构建
3.2.10 Cry9Aa突变体蛋白提取、纯化与定量
3.2.11 水稻二化螟杀虫活性测定
3.2.12 增效因子的计算
3.3 实验结果与分析
3.3.1 Cry9Aa蛋白的结构与疏水性分析
3.3.2 Cry9Aa蛋白结构域的分段表达
3.3.3 Cry9Aa各结构域片段与Vip3Aa蛋白的结合分析
3.3.4 Cry9Aa的loop突变体与Vip3Aa蛋白的结合分析
3.3.5 Cry9Aa合成肽段与Vip3Aa蛋白的结合情况分析
3.3.6 Cry9Aa参与结合的表位分析
3.3.7 Cry9Aa突变体的构建与表达
3.3.8 Cry9Aa突变体与Vip3Aa蛋白的结合分析
3.3.9 水稻二化螟杀虫活性测定
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 Vip3Aa蛋白协同增效关键位点的确定
4.1 实验材料
4.1.1 质粒信息
4.1.2 引物
4.1.3 供试昆虫
4.1.4 实验试剂与仪器设备
4.2 实验方法
4.2.1 Vip3Aa蛋白二级结构的预测
4.3 实验结果与分析
4.3.0 Vip3Aa蛋白重叠片段的构建与表达
4.3.1 Vip3Aa重叠片段与Cry9Aa蛋白的结合情况分析
4.3.2 Vip3Aa合成多肽与Cry9Aa蛋白的结合分析
4.3.3 Vip3Aa蛋白突变体的构建与表达
4.3.4 Vip3Aa突变体与Cry9Aa蛋白的结合分析
4.3.5 Vip3Aa蛋白二级结构的模拟
4.3.6 水稻二化螟的杀虫活性测定
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 对玉米害虫协同增效Bt杀虫蛋白组合的筛选
5.1 实验材料
5.1.1 菌株与质粒
5.1.2 引物
5.1.3 供试昆虫
5.1.4 实验试剂
5.1.5 常用溶液与缓冲液
5.2 实验方法
5.2.1 Bt杀虫基因的克隆
5.2.2 DNA片段双酶切及纯化
5.2.3 连接反应
5.2.4 热激转化
5.2.5 阳性克隆的鉴定
5.2.6 HD73-无晶体突变株感受态制备
5.2.7 电击转化
5.2.8 晶体形态观察
5.2.9 亚洲玉米螟和东方粘虫杀虫活性测定
5.3 实验结果与分析
5.3.1 Cry9Ee蛋白表达载体的构建
5.3.2 Cry9Ee蛋白在Bt中的表达
5.3.3 Cry9Ee蛋白的提取
5.3.4 Cry1Bb蛋白的载体构建与表达
5.3.5 Cry1Bb蛋白Ni亲和纯化
5.3.6 Cry1Ah和Cry1Ie蛋白的提取与纯化
5.3.7 亚洲玉米螟及东方粘虫杀虫活性测定
5.3.8 亚洲玉米螟BBMV的提取和定量
5.3.9 Cry9Ee与Cry1Ab在BBMV上的竞争结合实验
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历
本文编号：3786327
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3786327.html
