甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定及农杆菌介导的遗传转化体系建立

发布时间：2023-04-17 01:02

　　甜瓜(Cucumis melo L.)是我国最重要的葫芦科作物之一,栽培广泛,具有重要的经济价值。为害甜瓜的病害多达数十种,其中真菌病害最为普遍,侵染的真菌种类也较多,而且仍然存在新突发病害。本文鉴定一种甜瓜叶斑病,研究该病菌的生物学特性,筛选针对该病菌的杀菌剂,以期指导该病害的防控;同时应用农杆菌介导方法,创建该病菌的突变体库,为致病基因研究奠定基础。取得的主要研究结果如下:1、甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定2015年10月在我国广西武鸣甜瓜主要种植区进行病害调查时发现一种叶斑病。将病样分离病原真菌,通过形态学观察、多基因鉴定和致病性试验鉴定病原菌。在PDA平板上,病原菌菌落圆形,中间墨绿色,边缘浅褐色,气生菌丝茂盛。分生孢子呈圆柱形或倒棍棒形,单生或串生,直立或稍微弯曲,具0-13个隔膜,大小为3.1-6.4×14-138.9μm。通过克隆并测定该菌的4个保守序列ITS1,2、ITS4,5、ACT和TUB2,说明该菌为多主棒孢。甜瓜叶片上分离纯化的病原菌回接到甜瓜幼苗,表现出与病害调查时田间相似的症状并再次分离到同一病原菌。该菌通常危害植物叶片引起叶斑病,寄主广泛。接种该病原菌的西瓜(Cit...

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摘要
Abstract
缩略表
第一章 文献综述
    1.1 多主棒孢的研究进展
        1.1.1 多主棒孢的分类地位和特征
        1.1.2 多主棒孢的寄主范围及危害
        1.1.3 多主棒孢叶斑病的防治
    1.2 根癌农杆菌介导丝状真菌遗传转化研究进展
        1.2.1 ATMT技术在真菌上的应用与发展
        1.2.2 根癌农杆菌及其介导的真菌遗传转化
        1.2.3 ATMT相对于其他转化技术的优点
        1.2.4 ATMT技术在真菌中的研究趋势
        1.2.5 ATMT技术存在的问题和局限
        1.2.6 ATMT技术的未来及在真菌中的进一步应用
    1.3 本研究的目的和意义
第二章 甜瓜棒孢叶斑病菌鉴定
    2.1 前言
    2.2 材料与方法
        2.2.1 供试菌株
        2.2.2 试验试剂
        2.2.3 供试培养基
        2.2.4 仪器设备
        2.2.5 试验方法
            2.2.5.1 甜瓜棒孢叶斑病的标本采集
            2.2.5.2 病原菌的分离及纯化
            2.2.5.3 病原菌菌落形态观察
            2.2.5.4 病原菌分生孢子形态观察
            2.2.5.5 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取
            2.2.5.6 DNA提取质量和浓度检测
            2.2.5.7 甜瓜棒孢叶斑病菌的分子鉴定
            2.2.5.8 甜瓜棒孢叶斑病菌致病性测定
            2.2.5.9 温度对菌丝生长的影响
            2.2.5.10 pH对菌丝生长的影响
            2.2.5.11 碳源对菌丝生长的影响
            2.2.5.12 氮源对菌丝生长的影响
            2.2.5.13 病原菌分生孢子的萌发规律和方式
            2.2.5.14 pH对孢子萌发的影响
            2.2.5.15 碳源对孢子萌发的影响
            2.2.5.16 培养基种类对产孢的影响
            2.2.5.17 不同杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌的室内毒力测定
            2.2.5.18 数据处理
    2.3 结果与分析
        2.3.1 甜瓜棒孢叶斑病的田间症状
        2.3.2 甜瓜棒孢叶斑病菌菌落形态
        2.3.3 甜瓜棒孢叶斑病菌显微形态
        2.3.4 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取质量和浓度
        2.3.5 甜瓜棒孢叶斑病菌分子鉴定
        2.3.6 甜瓜棒孢叶斑病菌致病性测定
        2.3.7 温度对Cc-12 菌株生长的影响
        2.3.8 pH对 Cc-12 菌株生长的影响
        2.3.9 碳源对Cc-12 菌株生长的影响
        2.3.10 氮源对Cc-12 菌株生长的影响
        2.3.11 Cc-12 菌株分生孢子萌发规律和特点
        2.3.12 pH对孢子萌发的影响
        2.3.13 碳源对孢子萌发的影响
        2.3.14 培养基种类对产孢的影响
        2.3.15 22种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-SY菌株的室内毒力比较
        2.3.16 22种杀菌剂对甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-12 菌株的室内毒力比较
    2.4 讨论
第三章 甜瓜棒孢叶斑病菌全基因组测序
    3.1 前言
    3.2 材料与方法
        3.2.1 试验材料
        3.2.2 试验方法
            3.2.2.1 甜瓜棒孢叶斑病菌菌丝DNA提取
            3.2.2.2 建库测序和组装
            3.2.2.3 基因组注释
            3.2.2.4 比较基因组分析
    3.3 结果与分析
        3.3.1 基因组测序及组装
            3.3.1.1 二代数据量统计
            3.3.1.2 17-mer分析及基因组大小估计
            3.3.1.3 三代组装数据量统计
            3.3.1.4 基因组组装结果
            3.3.1.5 线粒体组装结果
            3.3.1.6 基因组组装评估
            3.3.1.7 单碱基深度统计图
            3.3.1.8 GC含量及深度分布分析
        3.3.2 基因组注释
            3.3.2.1 重复序列注释
            3.3.2.2 基因注释
        3.3.3 基因功能注释
            3.3.3.1 KEGG数据库注释
            3.3.3.2 GO数据库注释
            3.3.3.3 Swiss-Prot数据库注释
            3.3.3.4 NR数据库注释
            3.3.3.5 eggNOG数据库注释
            3.3.3.6 KOG数据库注释
        3.3.4 非编码RNA注释
        3.3.5 比较基因组分析
            3.3.5.1 基因家族鉴定
            3.3.5.2 系统发育分析
            5.3.5.3 分化时间估算
            3.3.5.4 基因家族扩张和收缩分析
            3.3.5.5 基因组共线性分析
        3.3.6 病原真菌致病性研究
            3.3.6.1 病原与宿主互作(PHI)数据库注释
            3.3.6.2 碳水化合物注释
            3.3.6.3 细胞色素P450 数据库(CYPs)注释
            3.3.6.4 分泌蛋白预测
            3.3.6.5 转运蛋白注释
            3.3.6.6 转录因子注释
            3.3.6.7 次级代谢产物注释
    3.4 讨论
第四章 根癌农杆菌介导的甜瓜棒孢叶斑病菌遗传转化体系的建立
    4.1 前言
    4.2 材料与方法
        4.2.1 菌株及质粒
        4.2.2 供试培养基
        4.2.3 试剂及耗材
        4.2.4 主要仪器设备
        4.2.5 试验方法
            4.2.5.1 质粒提取
            4.2.5.2 质粒转入大肠杆菌
            4.2.5.3 质粒转入农杆菌
            4.2.5.4 Cc-12 菌株对潮霉素的敏感性
            4.2.5.5 Cef抑制农杆菌正常生长的浓度筛选
            4.2.5.6 Tim抑制农杆菌正常生长的浓度筛选
            4.2.5.7 Cc-12 菌株对抗生素的敏感性
            4.2.5.8 分生孢子的制备
            4.2.5.9 根癌农杆菌细胞的制备
            4.2.5.10 根癌农杆菌与多主棒孢菌共培养
            4.2.5.11 转化子筛选
            4.2.5.12 pH对转化效率的影响
            4.2.5.13 共培养温度对转化效率的影响
            4.2.5.14 共培养时间对转化效率的影响
            4.2.5.15 根癌农杆菌浓度对转化效率的影响
            4.2.5.16 Ca²⁺浓度对转化效率的影响
            4.2.5.17 Cc-12 转化子基因组DNA的提取
            4.2.5.18 Cc-12 转化子的PCR鉴定
            4.2.5.19 Southern blot检测突变体的T-DNA插入拷贝数
            4.2.5.20 Cc-12 转化子的遗传稳定性分析
            4.2.5.21 表型变异突变体筛选
            4.2.5.22 致病性变异突变体筛选
            4.2.5.23 热不对称PCR
            4.2.5.24 重组质粒的筛选
            4.2.5.25 转化子完整T-DNA的扩增
    4.3 结果与分析
        4.3.1 质粒提取
        4.3.2 质粒转入农杆菌
        4.3.3 Cc-12 菌株对潮霉素的敏感性
        4.3.4 抑制农杆菌正常生长的Cef浓度筛选
        4.3.5 抑制农杆菌正常生长的Tim浓度筛选
        4.3.6 Cc-12 菌株对抗生素的敏感性
        4.3.7 根癌农杆菌介导的甜瓜棒孢叶斑病菌遗传转化
        4.3.8 Cc-12 转化子的PCR检测
        4.3.9 Southern blot检测Cc-12 转化子的T-DNA插入拷贝数
        4.3.10 Cc-12 转化子的遗传稳定性
        4.3.11 甜瓜棒孢叶斑病菌Cc-12 菌株转化子菌落形态特征比较
        4.3.12 表型变异突变体致病性测定
        4.3.13 致病性变异突变体Southern blot杂交分析
        4.3.14 T-DNA插入侧翼序列扩增
        4.3.15 T-DNA插入侧翼序列分析
        4.3.16 转化子完整T-DNA的扩增
    4.4 讨论
第五章 结论与展望
参考文献
附录Ⅰ 部分代表性转化菌株的菌落形态
附录Ⅱ 表型变异突变体致病性测定(使用孢子)
附录Ⅲ 表型变异突变体致病性测定(使用菌块)
附录Ⅳ 作者简介
致谢



本文编号：3792247