禾谷镰刀菌中cAMP-PKA下游基因FgSFL1的鉴定及功能分析
发布时间：2023-04-17 05:40
小麦赤霉病是危害粮食产量和安全的一种全球性病害,在气候条件适宜的条件下易暴发流行,危害面广且难以防控。在我国,引起赤霉病的主要病原菌是禾谷镰刀菌(Fusarium graminerium)。由于该病害抗性种质资源少,田间防控主要采用化学杀菌剂,虽然可以减少损失,但却为病害大爆发埋下了隐患。因此,深入研究禾谷镰刀菌的致病机制对于小麦赤霉病的防控显得十分重要。环腺苷酸依赖的蛋白激酶A(cAMP-PKA)作为一种在真核生物中广泛分布的保守激酶,在细胞分裂和生长、养份利用、逆境耐受等细胞生长的多个方面发挥调控作用。PKA激酶亦参与植物病原菌的的致病过程。禾谷镰刀菌有两个编码PKA催化亚基的基因CPK1和CPK2,它们的缺失导致菌株在营养生长、有性生殖、致病及产毒方面发生严重缺陷。在PDA上培养cpk1cpk2双敲突变体的过程中,发现该突变体可产生生长变快的角变子。本研究共收集了25个角变子,与cpk1cpk2双敲突变体相比,获得的角变子菌落生长完全回复,有性生殖和致病能力部分回复,分生孢子产量下降。全基因组测序找到了角变子上的突变基因FgSFL1,结合普通测序发现25个角变子在FgSFL1的1...
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述与研究概述
1.1 小麦赤霉病与禾谷镰刀菌简介
1.1.1 小麦赤霉病的危害
1.1.2 禾谷镰刀菌生物学特征
1.1.3 小麦赤霉病病害循环
1.2 禾谷镰刀菌研究概述
1.3 蛋白激酶研究概述
1.3.1 蛋白激酶简介
1.3.2 蛋白激酶在致病真菌中的研究进展
1.3.3 PKA激酶在致病真菌中的研究进展
1.4 转录因子研究概述
1.4.1 转录因子简介
1.4.2 转录因子受到的调控机制
1.4.3 禾谷镰刀菌中转录因子研究
1.4.4 转录因子Sfl1 的研究进展
第二章 cpk1cpk2 双敲突变体角变子的收集与功能鉴定
2.1 材料和仪器
2.2 实验方法
2.2.1 角变子的收集与单孢纯化
2.2.2 角变子表型鉴定
2.3 实验结果
2.3.1 角变子收集与单孢纯化
2.3.2 角变子表型鉴定
2.4 讨论与分析
第三章 角变子突变基因的鉴定与验证
3.1 材料与仪器
3.2 实验方法
3.2.1 角变子测序
3.2.2 构建同源重组片段
3.2.3 原生质体制备及PEG介导的转化
3.2.4 转化子PCR检测
3.2.5 突变体表型鉴定
3.3 实验结果
3.3.1 角变子内突变基因的鉴定
3.3.2 FgSFL1在DM-1 内的敲除检测
3.3.3 cpk1cpk2sfl1 三敲突变体表型鉴定
3.4 讨论与分析
第四章 FgSFL1 基因敲除与功能鉴定
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.2.1 FgSfl1在PH-1 中的敲除与PCR检测
4.2.2 Fgsfl1 转化子的Southern验证
4.2.3 小麦籽粒测产毒测定
4.2.4 玉米须侵染实验
4.3 实验结果
4.3.1 Fgsfl1 敲除转化子的鉴定
4.3.2 Fgsfl1 菌落形态观察
4.3.3 Fgsfl1 分生孢子产量、致病及DON毒素测定
4.3.4 Fgsfl1 有性生殖实验
4.4 讨论与分析
第五章 Fgsfl1 的互补与磷酸化位点鉴定
5.1 实验材料
5.2 实验方法
5.2.1 点突变引物设计
5.2.2 目的基因片段扩增及质粒提取
5.2.3 酵母感受态制备与转化
5.2.4 酵母检测与质粒提取
5.2.5 大肠杆菌电击转化及检测
5.2.6 突变体原生质体转化
5.3 实验结果
5.3.1 Fgsfl1 突变体功能互补
5.3.2 FgSfl1的PKA磷酸化位点的鉴定
5.4 讨论与分析
第六章 全文总结
参考文献
附录
致谢
作者简介
本文编号：3792683
【文章页数】：68 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 文献综述与研究概述
1.1 小麦赤霉病与禾谷镰刀菌简介
1.1.1 小麦赤霉病的危害
1.1.2 禾谷镰刀菌生物学特征
1.1.3 小麦赤霉病病害循环
1.2 禾谷镰刀菌研究概述
1.3 蛋白激酶研究概述
1.3.1 蛋白激酶简介
1.3.2 蛋白激酶在致病真菌中的研究进展
1.3.3 PKA激酶在致病真菌中的研究进展
1.4 转录因子研究概述
1.4.1 转录因子简介
1.4.2 转录因子受到的调控机制
1.4.3 禾谷镰刀菌中转录因子研究
1.4.4 转录因子Sfl1 的研究进展
第二章 cpk1cpk2 双敲突变体角变子的收集与功能鉴定
2.1 材料和仪器
2.2 实验方法
2.2.1 角变子的收集与单孢纯化
2.2.2 角变子表型鉴定
2.3 实验结果
2.3.1 角变子收集与单孢纯化
2.3.2 角变子表型鉴定
2.4 讨论与分析
第三章 角变子突变基因的鉴定与验证
3.1 材料与仪器
3.2 实验方法
3.2.1 角变子测序
3.2.2 构建同源重组片段
3.2.3 原生质体制备及PEG介导的转化
3.2.4 转化子PCR检测
3.2.5 突变体表型鉴定
3.3 实验结果
3.3.1 角变子内突变基因的鉴定
3.3.2 FgSFL1在DM-1 内的敲除检测
3.3.3 cpk1cpk2sfl1 三敲突变体表型鉴定
3.4 讨论与分析
第四章 FgSFL1 基因敲除与功能鉴定
4.1 实验材料
4.2 实验方法
4.2.1 FgSfl1在PH-1 中的敲除与PCR检测
4.2.2 Fgsfl1 转化子的Southern验证
4.2.3 小麦籽粒测产毒测定
4.2.4 玉米须侵染实验
4.3 实验结果
4.3.1 Fgsfl1 敲除转化子的鉴定
4.3.2 Fgsfl1 菌落形态观察
4.3.3 Fgsfl1 分生孢子产量、致病及DON毒素测定
4.3.4 Fgsfl1 有性生殖实验
4.4 讨论与分析
第五章 Fgsfl1 的互补与磷酸化位点鉴定
5.1 实验材料
5.2 实验方法
5.2.1 点突变引物设计
5.2.2 目的基因片段扩增及质粒提取
5.2.3 酵母感受态制备与转化
5.2.4 酵母检测与质粒提取
5.2.5 大肠杆菌电击转化及检测
5.2.6 突变体原生质体转化
5.3 实验结果
5.3.1 Fgsfl1 突变体功能互补
5.3.2 FgSfl1的PKA磷酸化位点的鉴定
5.4 讨论与分析
第六章 全文总结
参考文献
附录
致谢
作者简介
本文编号：3792683
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