基于CRISPR/Cas9技术的斜纹夜蛾PBP和BLOS2基因功能的研究
发布时间：2023-04-17 19:10
性信息素结合蛋白(Pheromone binding proteins,PBPs)在鳞翅目昆虫性信息素感受中起重要作用。近年研究发现,夜蛾科昆虫至少含有3个不同的PBP基因,但对于其功能分化及在性信息素感受中的相对重要性缺乏活体研究。CRISPR/Cas9基因编辑技术源于细菌和古细菌体内发现的一种获得性免疫机制,通过人工的改造,目前已成功的运用于多种生物,成为一种方便高效的基因功能研究工具。本研究以多食性夜蛾科害虫斜纹夜蛾为对象,首次利用CRISPR/Cas9技术对3个PBP基因分别进行敲除并获得相应的纯合突变品系,然后利用电生理和行为测定技术阐述了斜纹夜蛾3个不同PBP基因在性信息素感受中的功能及相对重要性,研究结果对于明确夜蛾科昆虫性信息素分子感受机制及设计和开发更为高效的基于嗅觉的害虫防控技术有重要意义。此外还克隆了斜纹夜蛾的BLOS2基因,利用CRISPR/Cas9技术明确了其在幼虫表皮颜色形成中的决定性作用,为斜纹夜蛾及其他夜蛾类昆虫的基因工程研究提供一个重要的标记基因。本研究同时为斜纹夜蛾及其他鳞翅目害虫的基因编辑提供了重要技术参考。主要研究结果如下:1.运用CRISPR/...
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语
第一章 文献综述
1.1 CRISPR/CAS系统介绍
1.1.1 研究历史
1.1.2 结构和组成
1.1.2.1 CRISPR结构
1.1.2.2 Cas基因
1.1.2.3 CRISPR/Cas系统
1.1.3 作用机制
1.2 CRISPR/CAS9系统
1.2.1 研究现状
1.2.2 昆虫研究中的应用
1.3 昆虫嗅觉机制研究进展
1.3.1 昆虫嗅觉的一般过程
1.3.2 昆虫气味结合蛋白
1.3.3 鳞翅目昆虫性信息素结合蛋白
1.4 昆虫BLOS2基因研究进展
1.5 本研究的目的和意义
第二章 斜纹夜蛾PBP1基因的敲除及功能分析
2.1 实验材料与方法
2.1.1 供试昆虫
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 主要试剂
2.1.4 靶标位点的选择
2.1.5 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录合成
2.1.5.1 sgRNA转录模板的制备
2.1.5.2 sgRNA的体外转录
2.1.5.3 Cas9 mRNA体外转录合成
2.1.6 卵的显微注射及突变检测
2.1.6.1 显微注射
2.1.6.2 突变检测
2.1.7 脱靶效应的检测
2.1.8 纯合突变品系的选育
2.1.9 Western-blot检测
2.1.10 触角电位(EAG)的测定
2.1.11 行为学和Y型嗅觉仪检测
2.1.12 触角转录组测序
2.2 结果与分析
2.2.1 PBP1基因的敲除
2.2.2 突变品系的选育
2.2.3 脱靶检测
2.2.4 Westen-blot杂交检测
2.2.5 PBP1突变品系对性信息素组分的EAG反应
2.2.6 PBP1突变品系行为反应测定
2.2.7 PBP1突变品系RNA-seq分析
2.2.7.1 两个品系的转录组数据概况
2.2.7.2 两个品系差异基因的数量
2.2.7.3 两个品系差异基因的KEGG通路分析
2.2.7.4 两个品系差异基因的COG分析
2.3 讨论
第三章 斜纹夜蛾PBP2和PBP3基因的敲除及功能分析
3.1 材料与方法
3.1.1 供试昆虫
3.1.2 主要试剂与设备
3.1.3 靶标位点的选择
3.1.4 sgRNA和Cas9 mRNA的体外合成
3.1.5 卵的显微注射及突变检测
3.1.6 纯合突变品系的选育
3.1.7 脱靶效应的检测
3.1.8 触角电位(EAG)测定
3.1.9 行为测定
3.2 结果与分析
3.2.1 PBP2和PBP3基因的敲除
3.2.2 突变品系的筛选
3.2.3 脱靶检测
3.2.4 突变品系对性信息素组分的EAG反应
3.2.5 PBP2突变品系行为反应测定
3.3 讨论
第四章 斜纹夜蛾BLOS2基因的克隆及功能分析
4.1 材料与方法
4.1.1 供试昆虫
4.1.2 主要试剂与设备
4.1.3 BLOS2基因的克隆与序列分析
4.1.3.1 总RNA和基因组DNA的提取及cDNA第一链的合成
4.1.3.2 RACE技术扩增获得BLOS2基因的cDNA全长
4.1.3.3 PCR扩增BLOS2基因的基因组全长
4.1.3.4 BLOS2基因的系统发育分析
4.1.3.5 BLOS2基因时间表达动态测定
4.2 CRISPR/CAS9对BLOS2基因功能的分析
4.2.1 sgRNA靶标位点的选择
4.2.2 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录合成
4.2.3 显微注射
4.2.4 突变体观察与分析
4.2.5 脱靶分析
4.3 结果与分析
4.3.1 BLOS2基因的克隆和序列分析
4.3.2 BLOS2基因的时间动态表达
4.3.3 CRISPR/Cas9系统敲除BLOS2基因
4.3.4 纯合突变体的选育
4.3.5 脱靶分析
4.4 讨论
全文总结
参考文献
攻读博士期间学术论文的发表及参加学术会议
致谢
本文编号：3792728
【文章页数】：150 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
缩略语
第一章 文献综述
1.1 CRISPR/CAS系统介绍
1.1.1 研究历史
1.1.2 结构和组成
1.1.2.1 CRISPR结构
1.1.2.2 Cas基因
1.1.2.3 CRISPR/Cas系统
1.1.3 作用机制
1.2 CRISPR/CAS9系统
1.2.1 研究现状
1.2.2 昆虫研究中的应用
1.3 昆虫嗅觉机制研究进展
1.3.1 昆虫嗅觉的一般过程
1.3.2 昆虫气味结合蛋白
1.3.3 鳞翅目昆虫性信息素结合蛋白
1.4 昆虫BLOS2基因研究进展
1.5 本研究的目的和意义
第二章 斜纹夜蛾PBP1基因的敲除及功能分析
2.1 实验材料与方法
2.1.1 供试昆虫
2.1.2 主要仪器设备
2.1.3 主要试剂
2.1.4 靶标位点的选择
2.1.5 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录合成
2.1.5.1 sgRNA转录模板的制备
2.1.5.2 sgRNA的体外转录
2.1.5.3 Cas9 mRNA体外转录合成
2.1.6 卵的显微注射及突变检测
2.1.6.1 显微注射
2.1.6.2 突变检测
2.1.7 脱靶效应的检测
2.1.8 纯合突变品系的选育
2.1.9 Western-blot检测
2.1.10 触角电位(EAG)的测定
2.1.11 行为学和Y型嗅觉仪检测
2.1.12 触角转录组测序
2.2 结果与分析
2.2.1 PBP1基因的敲除
2.2.2 突变品系的选育
2.2.3 脱靶检测
2.2.4 Westen-blot杂交检测
2.2.5 PBP1突变品系对性信息素组分的EAG反应
2.2.6 PBP1突变品系行为反应测定
2.2.7 PBP1突变品系RNA-seq分析
2.2.7.1 两个品系的转录组数据概况
2.2.7.2 两个品系差异基因的数量
2.2.7.3 两个品系差异基因的KEGG通路分析
2.2.7.4 两个品系差异基因的COG分析
2.3 讨论
第三章 斜纹夜蛾PBP2和PBP3基因的敲除及功能分析
3.1 材料与方法
3.1.1 供试昆虫
3.1.2 主要试剂与设备
3.1.3 靶标位点的选择
3.1.4 sgRNA和Cas9 mRNA的体外合成
3.1.5 卵的显微注射及突变检测
3.1.6 纯合突变品系的选育
3.1.7 脱靶效应的检测
3.1.8 触角电位(EAG)测定
3.1.9 行为测定
3.2 结果与分析
3.2.1 PBP2和PBP3基因的敲除
3.2.2 突变品系的筛选
3.2.3 脱靶检测
3.2.4 突变品系对性信息素组分的EAG反应
3.2.5 PBP2突变品系行为反应测定
3.3 讨论
第四章 斜纹夜蛾BLOS2基因的克隆及功能分析
4.1 材料与方法
4.1.1 供试昆虫
4.1.2 主要试剂与设备
4.1.3 BLOS2基因的克隆与序列分析
4.1.3.1 总RNA和基因组DNA的提取及cDNA第一链的合成
4.1.3.2 RACE技术扩增获得BLOS2基因的cDNA全长
4.1.3.3 PCR扩增BLOS2基因的基因组全长
4.1.3.4 BLOS2基因的系统发育分析
4.1.3.5 BLOS2基因时间表达动态测定
4.2 CRISPR/CAS9对BLOS2基因功能的分析
4.2.1 sgRNA靶标位点的选择
4.2.2 sgRNA和Cas9 mRNA的体外转录合成
4.2.3 显微注射
4.2.4 突变体观察与分析
4.2.5 脱靶分析
4.3 结果与分析
4.3.1 BLOS2基因的克隆和序列分析
4.3.2 BLOS2基因的时间动态表达
4.3.3 CRISPR/Cas9系统敲除BLOS2基因
4.3.4 纯合突变体的选育
4.3.5 脱靶分析
4.4 讨论
全文总结
参考文献
攻读博士期间学术论文的发表及参加学术会议
致谢
本文编号：3792728
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