Nbnrp1蛋白介导大丽轮枝菌激发子PevD1诱导本生烟抗病性的分子机制
发布时间：2023-05-06 19:56
PevD1是作者实验室从大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)XII8菌株发酵液中分离获得的蛋白激发子。Nbnrp1是前期筛选出的PevD1在本生烟中的互作蛋白,利用RNAi技术获得了Nbnrp1-RNAi转基因本生烟植株,初步证明Nbnrp1能调控PevD1诱导的细胞坏死和抗病性。本文在前期的基础上,进一步明确了Nbnrp1在PevD1诱导本生烟产生抗病性中的作用,并通过转录组测序的方法,对本生烟野生型(WT)和Nbnrp1沉默株系(Nbnrp1-RNAi)在PevD1诱导前后的差异表达基因进行筛选及功能分析,阐述了Nbnrp1调控PevD1诱导本生烟抗病性的分子机制,主要研究结果如下:1.建立了PevD1的真核表达体系,获得了纯化的真核表达蛋白构建了PevD1的真核表达载体pPICZαA-PevD1,并通过电转的方法将表达载体转入毕赤酵母感受态中;经博莱霉素Zeocin抗性筛选,获得阳性转化子并进行PevD1蛋白的诱导表达和纯化;通过SDS-PAGE和Western blot技术验证了融合蛋白的正确性;纯化的PevD1蛋白能够诱导本生烟叶片产生细胞坏死(HR反应),...
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 激发子的研究现状
1.2 植物诱导抗病性的机制研究
1.3 萜类次生代谢产物与植物抗性
1.4 转录组测序技术及应用
1.4.1 转录组测序技术
1.4.2 转录组测序技术在植物抗病机制研究中的应用
1.5 蛋白激发子PEVD1 的研究背景
1.5.1 激发子PevD1 的分离及功能研究
1.5.2 PevD1 诱导植物抗病的机制研究
1.6 NRP蛋白的研究背景
1.7 本研究的目的及意义
1.8 本研究技术路线
第二章 PEVD1 的真核表达与纯化
2.1 实验材料
2.1.1 质粒和菌株
2.1.2 试剂和仪器
2.1.3 培养基与试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 PevD1 真核表达载体的构建
2.2.2 酵母感受态的制备、转化
2.2.3 PevD1 的真核表达
2.2.4 PevD1 的纯化
2.2.5 PevD1 蛋白浓度的测定
2.2.6 PevD1的Western-blot鉴定
2.2.7 真核表达的PevD1 诱导本生烟HR的活性检测
2.3 实验结果
2.3.1 PevD1 真核表达载体的构建
2.3.2 PevD1 的表达、纯化、鉴定及活性检测
2.4 本章小结
第三章 NBNRP1 正调控PEVD1 诱导本生烟产生的防御反应和系统抗性
3.1 实验材料
3.1.1 菌株和植物材料
3.1.2 实验试剂和仪器
3.1.3 培养基与试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 植物培养
3.2.2 DAB组织染色法检测过氧化氢的沉积
3.2.3 PevD1 诱导胼胝质的产生
3.2.4 PevD1 诱导MAPK级联反应的激活
3.2.5 PevD1 诱导本生烟对 TMV 的抗性实验
3.2.6 PevD1 诱导本生烟对大丽轮枝菌的抗性实验
3.3 结果与分析
3.3.1 过氧化氢沉积的检测
3.3.2 胼胝质沉淀的观察
3.3.3 MAPK 级联反应激活检测
3.3.4 PevD1诱导本生烟对TMV的抗性实验
3.3.5 PevD1诱导本生烟对大丽轮枝菌的抗性实验
3.4 本章小结
第四章 转录组测序
4.1 实验材料
4.1.1 激发子与植物材料
4.1.2 实验试剂和仪器
4.2 实验方法
4.2.1 植株的准备
4.2.2 PevD1 处理本生烟
4.2.3 取样、RNA的提取及质量检测
4.2.4 文库构建及测序
4.2.5 测序数据的过滤及参考基因组的比对
4.2.6 基因表达定量
4.2.7 差异表达基因的筛选
4.2.8 差异表达基因的GO分析
4.2.9 差异表达基因的Pathway分析
4.3 结果及分析
4.3.1 RNA的质量检测
4.3.2 测序数据的质控和参考基因组的比对
4.3.3 样品的相关性分析
4.3.4 差异表达基因(DEGs)的筛选及功能分析
4.4 本章小结
第五章 转录组差异表达基因的定量验证
5.1 实验材料
5.1.1 植物材料
5.1.2 实验试剂和仪器
5.2 实验方法
5.2.1 qPCR引物设计
5.2.2 RNA提取及反转录
5.2.3 qPCR反应体系及程序
5.2.4 qPCR结果统计与分析
5.3 结果及分析
5.3.1 转录组中抗病相关差异表达基因的验证
5.3.2 倍半萜类次生代谢产物合成相关基因的qPCR验证
5.4 本章小结
第六章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3809525
【文章页数】：82 页
【学位级别】：硕士
【文章目录】：
摘要
abstract
英文缩略表
第一章 引言
1.1 激发子的研究现状
1.2 植物诱导抗病性的机制研究
1.3 萜类次生代谢产物与植物抗性
1.4 转录组测序技术及应用
1.4.1 转录组测序技术
1.4.2 转录组测序技术在植物抗病机制研究中的应用
1.5 蛋白激发子PEVD1 的研究背景
1.5.1 激发子PevD1 的分离及功能研究
1.5.2 PevD1 诱导植物抗病的机制研究
1.6 NRP蛋白的研究背景
1.7 本研究的目的及意义
1.8 本研究技术路线
第二章 PEVD1 的真核表达与纯化
2.1 实验材料
2.1.1 质粒和菌株
2.1.2 试剂和仪器
2.1.3 培养基与试剂配制
2.2 实验方法
2.2.1 PevD1 真核表达载体的构建
2.2.2 酵母感受态的制备、转化
2.2.3 PevD1 的真核表达
2.2.4 PevD1 的纯化
2.2.5 PevD1 蛋白浓度的测定
2.2.6 PevD1的Western-blot鉴定
2.2.7 真核表达的PevD1 诱导本生烟HR的活性检测
2.3 实验结果
2.3.1 PevD1 真核表达载体的构建
2.3.2 PevD1 的表达、纯化、鉴定及活性检测
2.4 本章小结
第三章 NBNRP1 正调控PEVD1 诱导本生烟产生的防御反应和系统抗性
3.1 实验材料
3.1.1 菌株和植物材料
3.1.2 实验试剂和仪器
3.1.3 培养基与试剂配制
3.2 实验方法
3.2.1 植物培养
3.2.2 DAB组织染色法检测过氧化氢的沉积
3.2.3 PevD1 诱导胼胝质的产生
3.2.4 PevD1 诱导MAPK级联反应的激活
3.2.5 PevD1 诱导本生烟对 TMV 的抗性实验
3.2.6 PevD1 诱导本生烟对大丽轮枝菌的抗性实验
3.3 结果与分析
3.3.1 过氧化氢沉积的检测
3.3.2 胼胝质沉淀的观察
3.3.3 MAPK 级联反应激活检测
3.3.4 PevD1诱导本生烟对TMV的抗性实验
3.3.5 PevD1诱导本生烟对大丽轮枝菌的抗性实验
3.4 本章小结
第四章 转录组测序
4.1 实验材料
4.1.1 激发子与植物材料
4.1.2 实验试剂和仪器
4.2 实验方法
4.2.1 植株的准备
4.2.2 PevD1 处理本生烟
4.2.3 取样、RNA的提取及质量检测
4.2.4 文库构建及测序
4.2.5 测序数据的过滤及参考基因组的比对
4.2.6 基因表达定量
4.2.7 差异表达基因的筛选
4.2.8 差异表达基因的GO分析
4.2.9 差异表达基因的Pathway分析
4.3 结果及分析
4.3.1 RNA的质量检测
4.3.2 测序数据的质控和参考基因组的比对
4.3.3 样品的相关性分析
4.3.4 差异表达基因(DEGs)的筛选及功能分析
4.4 本章小结
第五章 转录组差异表达基因的定量验证
5.1 实验材料
5.1.1 植物材料
5.1.2 实验试剂和仪器
5.2 实验方法
5.2.1 qPCR引物设计
5.2.2 RNA提取及反转录
5.2.3 qPCR反应体系及程序
5.2.4 qPCR结果统计与分析
5.3 结果及分析
5.3.1 转录组中抗病相关差异表达基因的验证
5.3.2 倍半萜类次生代谢产物合成相关基因的qPCR验证
5.4 本章小结
第六章 全文结论
参考文献
附录
致谢
作者简历
本文编号：3809525
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