马铃薯青枯菌毒力效应蛋白的筛选及效应蛋白Rip25的毒力机制研究
发布时间：2023-05-07 07:24
马铃薯与演化型IIB青枯菌共同起源于南美,具有悠久的共进化历史。然而我们对两者之间的互作机制却了解甚少。由于马铃薯栽培品种缺乏青枯病抗源且对两者互作关系的认知不足,马铃薯青枯病抗病育种收效甚微。三型分泌系统效应蛋白是青枯菌干扰植物免疫的重要武器,然而目前青枯菌效应蛋白的功能研究报道仍旧较少。青枯菌复合种具有近100个效应蛋白家族,因此建立系统的筛选体系来确定研究对象至关重要。基于此,我们建立了一个多重筛选系统(马铃薯效应突变体的毒力筛选,酵母的生长抑制筛选和本氏烟草的瞬时表达筛选)来鉴定马铃薯青枯菌的核心效应子,为深入效应蛋白功能提供更多的研究视角和研究手段,同时我们也对Rip25效应蛋白的毒力功能进行了进一步的深入研究,为马铃薯青枯病抗病机制提供理论支撑。本研究包括以下几个方面内容:1.演化型IIB青枯菌核心效应蛋白的筛选a)我们利用了野生型菌株UW551及其三型分泌系统突变体Δhrc V进行了马铃薯接种鉴定。结果显示,突变体Δhrc V无法对马铃薯植株形成侵染;而且突变体对薯块的侵染能力也显著下降。这表明三型分泌系统对马铃薯侵染至关重要。b)我们对13个已测序演化型IIB青枯菌的效...
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
1.1 引言
1.2 青枯菌的致病机理
1.2.1 青枯菌的分类
1.2.2 青枯菌的寄主范围与生存周期
1.2.3 青枯菌的致病系统
1.3 青枯菌抗病研究
1.3.1 模式植物拟南芥青枯病抗性研究进展
1.3.2 马铃薯青枯病抗性研究概况
1.4 青枯菌III型分泌系统效应蛋白毒力功能研究进展
1.4.1 青枯病毒力效应蛋白的筛选
1.4.2 青枯菌效应蛋白干扰植物PTI
1.4.3 青枯菌效应蛋白干扰蛋白泛素化
1.4.4 青枯菌效应蛋白与细胞死亡
1.4.5 青枯菌效应蛋白RipAY的研究进展
1.5 细菌半胱氨酸蛋白类效应蛋白的研究进展
1.5.1 动物病原半胱氨酸蛋白酶效应蛋白
1.5.2 植物病原半胱氨酸蛋白酶效应蛋白
1.6 植物细胞的程序性死亡
1.6.1 蛋白酶参与的细胞死亡过程
1.6.2 自噬参与的细胞死亡过程
1.7 本研究意义内容与技术路线
1.7.1 研究意义
1.7.2 研究内容
1.7.3 研究技术路线
第二章 材料和方法
2.1 本实验所用材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 工程菌株
2.1.3 实验质粒
2.1.4 本实验所用的青枯菌
2.2 生物信息学分析数据库
2.3 分子克隆相关
2.3.1 分子克隆所用试剂
2.3.2 基因克隆及检测
2.3.3 点突变的构建
2.4 青枯菌突变体构建
2.4.1 突变体片段构建
2.4.2 青枯菌转化
2.4.3 超量表达Rip25 青枯菌构建
2.4.4 青枯菌运动性测定
2.5 马铃薯青枯病抗性鉴定
2.5.1 马铃薯植株接种鉴定
2.5.2 马铃薯薯块接种实验
2.6 酵母菌的转化及诱导表达
2.7 酵母生长抑制筛选
2.8 烟草瞬时表达相关
2.8.1 农杆菌转化
2.8.2 烟草细胞瞬时表达
2.8.3 细胞死亡统计
2.9 蛋白免疫印迹
2.10 免疫沉淀质谱鉴定
2.11 共聚焦显微镜观察亚细胞结构
2.12 病毒诱导的基因沉默
2.12.1 本课题所沉默的基因信息
2.12.2 TRV介导的基因沉默
2.12.3 RNA提取与反转录
2.12.4 RT-PCR
第三章 结果与分析
3.1 演化型 IIB 青枯菌核心效应蛋白的筛选
3.1.1 三型分泌系统对马铃薯青枯菌致病的作用
3.1.2 青枯菌 UW551 效应蛋白家族的核心生物信息分析
3.1.3 核心效应蛋白突变体的构建与毒力筛选
3.1.4 核心效应蛋白的酵母生长抑制筛选
3.1.5 效应蛋白烟草瞬时表达表型与亚细胞定位
3.1.6 核心效应蛋白筛选结果汇总
3.2 Rip25 效应蛋白毒力功能的研究
3.2.1 Rip25 效应蛋白是一个促进马铃薯致病的毒力蛋白
3.2.2 Rip25 在烟草中能形成细胞死亡并能够抑制酵母生长
3.2.3 Rip25 具有半胱氨酸蛋白酶结构和锚定蛋白重复结构域
3.2.4 N端酶活中心与C端锚蛋白重复区的对毒力表型具有重要作用
3.2.5 Rip25 蛋白在烟草和酵母表达下N端具有自切割活性
3.2.6 Rip25 的锚定蛋白重复序列参与了蛋白切割位点识别
3.3 Rip25 细胞死亡信号通路的研究
3.3.1 沉默免疫相关基因无法干扰Rip25 介导的细胞死亡
3.3.2 Rip25 在烟草细胞产生的细胞死亡过程伴随细胞自噬
3.3.3 沉默细胞自噬相关基因不能干扰Rip25 的细胞死亡
第四章 讨论
4.1 酵母细胞中StHMO1 回补Rip25 介导酵母抑制生长
4.2 Rip25具有低温酶活适应性
4.3 Rip6与 Rip25的毒力机制的异同
4.4 三种效应蛋白筛选方法具有不同的优势
4.5 未知功能的细菌效应蛋白研究策略
4.6 Rip25 蛋白酶自切割的作用
4.7 锚定蛋白重复序列的功能
4.8 Rip25 介导细胞死亡机制
参考文献
附录一 本研究所用质粒菌株及引物
附录二 抑制子酵母筛选文库筛选结果
附录三 读博期间发表文章
致谢
本文编号：3810548
【文章页数】：140 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
Abstract
缩略词表
第一章 前言
1.1 引言
1.2 青枯菌的致病机理
1.2.1 青枯菌的分类
1.2.2 青枯菌的寄主范围与生存周期
1.2.3 青枯菌的致病系统
1.3 青枯菌抗病研究
1.3.1 模式植物拟南芥青枯病抗性研究进展
1.3.2 马铃薯青枯病抗性研究概况
1.4 青枯菌III型分泌系统效应蛋白毒力功能研究进展
1.4.1 青枯病毒力效应蛋白的筛选
1.4.2 青枯菌效应蛋白干扰植物PTI
1.4.3 青枯菌效应蛋白干扰蛋白泛素化
1.4.4 青枯菌效应蛋白与细胞死亡
1.4.5 青枯菌效应蛋白RipAY的研究进展
1.5 细菌半胱氨酸蛋白类效应蛋白的研究进展
1.5.1 动物病原半胱氨酸蛋白酶效应蛋白
1.5.2 植物病原半胱氨酸蛋白酶效应蛋白
1.6 植物细胞的程序性死亡
1.6.1 蛋白酶参与的细胞死亡过程
1.6.2 自噬参与的细胞死亡过程
1.7 本研究意义内容与技术路线
1.7.1 研究意义
1.7.2 研究内容
1.7.3 研究技术路线
第二章 材料和方法
2.1 本实验所用材料
2.1.1 植物材料
2.1.2 工程菌株
2.1.3 实验质粒
2.1.4 本实验所用的青枯菌
2.2 生物信息学分析数据库
2.3 分子克隆相关
2.3.1 分子克隆所用试剂
2.3.2 基因克隆及检测
2.3.3 点突变的构建
2.4 青枯菌突变体构建
2.4.1 突变体片段构建
2.4.2 青枯菌转化
2.4.3 超量表达Rip25 青枯菌构建
2.4.4 青枯菌运动性测定
2.5 马铃薯青枯病抗性鉴定
2.5.1 马铃薯植株接种鉴定
2.5.2 马铃薯薯块接种实验
2.6 酵母菌的转化及诱导表达
2.7 酵母生长抑制筛选
2.8 烟草瞬时表达相关
2.8.1 农杆菌转化
2.8.2 烟草细胞瞬时表达
2.8.3 细胞死亡统计
2.9 蛋白免疫印迹
2.10 免疫沉淀质谱鉴定
2.11 共聚焦显微镜观察亚细胞结构
2.12 病毒诱导的基因沉默
2.12.1 本课题所沉默的基因信息
2.12.2 TRV介导的基因沉默
2.12.3 RNA提取与反转录
2.12.4 RT-PCR
第三章 结果与分析
3.1 演化型 IIB 青枯菌核心效应蛋白的筛选
3.1.1 三型分泌系统对马铃薯青枯菌致病的作用
3.1.2 青枯菌 UW551 效应蛋白家族的核心生物信息分析
3.1.3 核心效应蛋白突变体的构建与毒力筛选
3.1.4 核心效应蛋白的酵母生长抑制筛选
3.1.5 效应蛋白烟草瞬时表达表型与亚细胞定位
3.1.6 核心效应蛋白筛选结果汇总
3.2 Rip25 效应蛋白毒力功能的研究
3.2.1 Rip25 效应蛋白是一个促进马铃薯致病的毒力蛋白
3.2.2 Rip25 在烟草中能形成细胞死亡并能够抑制酵母生长
3.2.3 Rip25 具有半胱氨酸蛋白酶结构和锚定蛋白重复结构域
3.2.4 N端酶活中心与C端锚蛋白重复区的对毒力表型具有重要作用
3.2.5 Rip25 蛋白在烟草和酵母表达下N端具有自切割活性
3.2.6 Rip25 的锚定蛋白重复序列参与了蛋白切割位点识别
3.3 Rip25 细胞死亡信号通路的研究
3.3.1 沉默免疫相关基因无法干扰Rip25 介导的细胞死亡
3.3.2 Rip25 在烟草细胞产生的细胞死亡过程伴随细胞自噬
3.3.3 沉默细胞自噬相关基因不能干扰Rip25 的细胞死亡
第四章 讨论
4.1 酵母细胞中StHMO1 回补Rip25 介导酵母抑制生长
4.2 Rip25具有低温酶活适应性
4.3 Rip6与 Rip25的毒力机制的异同
4.4 三种效应蛋白筛选方法具有不同的优势
4.5 未知功能的细菌效应蛋白研究策略
4.6 Rip25 蛋白酶自切割的作用
4.7 锚定蛋白重复序列的功能
4.8 Rip25 介导细胞死亡机制
参考文献
附录一 本研究所用质粒菌株及引物
附录二 抑制子酵母筛选文库筛选结果
附录三 读博期间发表文章
致谢
本文编号：3810548
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3810548.html
