拟南芥钙离子依赖蛋白激酶CPK5/6磷酸化几丁质受体调控免疫反应的研究
发布时间：2023-05-08 05:36
植物病害是人类面对的一个严峻的挑战,严重影响粮食产量以及人类的健康。利用植物自身的抗性基因抵抗病原菌的入侵,不仅可以保护植物自身,更可以减少农药的使用从而有利于保护环境。几丁质作为真菌细胞壁的主要成分之一,是一种典型的微生物相关的分子模式。在拟南芥中,几丁质被位于细胞膜上的两个Lys M受体—CERK1和LYK5识别,从而激发植物的免疫反应。前期的研究表明LYK5的功能主要是识别几丁质,CERK1主要通过胞内激酶传递免疫信号。LYK5的胞内结构域是一个假激酶,但在几丁质引起的免疫信号传递中不可缺少。为了研究LYK5胞内结构域在几丁质引起的免疫信号通路中的功能,我们开展了如下研究:1. 在拟南芥中过表达LYK5-Myc融合蛋白,并筛选稳定表达的LYK5-Myc转基因株系。使用几丁质处理前处前和处理后的LYK5-Myc转基因拟南芥幼苗进行蛋白亲和纯化,纯化出的LYK5受体复合体应用于蛋白组分析,鉴定到48个可能与LYK5互作的蛋白;2. 钙离子依赖的蛋白激酶CPK5和CPK6是LYK5蛋白复合物中两个组分。我们使用双分子荧光互补试验(Bi FC)验证了CPK5和CPK6与LYK5互作,使用...
【文章页数】：96 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略表
第一章 植物免疫系统的研究综述
1.植物PTI免疫系统
1.1 模式识别受体
1.1.1 PRRs及对应PAMPs
1.1.2 PRRs受体复合体及下游信号组分
1.2 植物PTI其他免疫反应
1.2.1 MAPK级联反应
1.2.2 ROS,Ca2+爆发
1.3 植物PTI反应调控
1.3.1 磷酸化和去磷酸化在PTI中的功能
1.3.2 泛素化修饰在PTI信号通路中的影响
2.植物的ETI调控系统
2.1 效应蛋白对植物PTI的影响
2.1.1 效应蛋白对PRRs的抑制作用
2.1.2 效应蛋白对MAPK级联反应的影响
2.2 植物体内的R基因及对应的效应蛋白识别
3.钙调蛋白的功能研究
3.1 植物中受钙离子调节的蛋白激酶
3.2 CDPKs在植物中的功能研究
4.研究目的和意义
第二章 材料和方法
1.1 质粒载体和菌株
1.2 拟南芥的种植和生长管理
1.2.1 材料
1.2.2 方法
1.3 拟南芥稳定转化
1.3.1 材料和试剂
1.3.2 载体构建
1.3.3 拟南芥稳定转化
1.4 亲和纯化LYK5-Myc受体复合体蛋白
1.4.1 试剂和材料
1.4.2 实验方法
1.5 双分子荧光互补实验
1.5.1 载体构建
1.5.2 在烟草叶片中瞬时表达分析
1.6 蛋白免疫印迹实验
1.6.1 SDS-PAGE凝胶制备
1.6.2 转膜
1.6.3 孵育抗体和曝光
1.7 免疫共沉淀实验
1.7.1 试剂与材料
1.7.2 方法与步骤
1.8 体外蛋白纯化实验
1.8.1 载体构建
1.8.2 转化E.coli BL21 Condon Plus(DE3)菌株
1.8.3 蛋白诱导表达检测
1.8.4 体外亲和纯化标签蛋白质
1.9 体外磷酸化实验
1.9.1 试剂和材料
1.9.2 步骤
1.10 荧光定量分析基因相对表达
1.10.1 RNA提取
1.10.2 RNA反转录c DNA
1.10.3 q RT-PCR反应
1.10.4 q RT-PCR数据分析
1.11 活性氧测定
1.11.1 试剂及材料
1.11.2 步骤
1.12 胼胝体沉淀染色
1.12.1 试剂和材料
1.12.2 实验步骤
第三章 结果与分析
1.鉴定与LYK5互作的蛋白
2.CPK5缺失突变影响几丁质引起的免疫反应
3.几丁质受体LYK5和LYK4 胞内结构域受CPK5和CPK6 磷酸化调控
4.CPK5 磷酸化LYK5 胞内结构域位点的鉴定
5.LYK5磷酸化位点突变体表型鉴定
6.CPK5 稳定CERK1 蛋白水平的研究
第四章 讨论
参考文献
附录一 本课题所用引物序列
附录二
附录三 在读期间发表论文
致谢
本文编号：3812094
【文章页数】：96 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
abstract
缩略表
第一章 植物免疫系统的研究综述
1.植物PTI免疫系统
1.1 模式识别受体
1.1.1 PRRs及对应PAMPs
1.1.2 PRRs受体复合体及下游信号组分
1.2 植物PTI其他免疫反应
1.2.1 MAPK级联反应
1.2.2 ROS,Ca2+爆发
1.3 植物PTI反应调控
1.3.1 磷酸化和去磷酸化在PTI中的功能
1.3.2 泛素化修饰在PTI信号通路中的影响
2.植物的ETI调控系统
2.1 效应蛋白对植物PTI的影响
2.1.1 效应蛋白对PRRs的抑制作用
2.1.2 效应蛋白对MAPK级联反应的影响
2.2 植物体内的R基因及对应的效应蛋白识别
3.钙调蛋白的功能研究
3.1 植物中受钙离子调节的蛋白激酶
3.2 CDPKs在植物中的功能研究
4.研究目的和意义
第二章 材料和方法
1.1 质粒载体和菌株
1.2 拟南芥的种植和生长管理
1.2.1 材料
1.2.2 方法
1.3 拟南芥稳定转化
1.3.1 材料和试剂
1.3.2 载体构建
1.3.3 拟南芥稳定转化
1.4 亲和纯化LYK5-Myc受体复合体蛋白
1.4.1 试剂和材料
1.4.2 实验方法
1.5 双分子荧光互补实验
1.5.1 载体构建
1.5.2 在烟草叶片中瞬时表达分析
1.6 蛋白免疫印迹实验
1.6.1 SDS-PAGE凝胶制备
1.6.2 转膜
1.6.3 孵育抗体和曝光
1.7 免疫共沉淀实验
1.7.1 试剂与材料
1.7.2 方法与步骤
1.8 体外蛋白纯化实验
1.8.1 载体构建
1.8.2 转化E.coli BL21 Condon Plus(DE3)菌株
1.8.3 蛋白诱导表达检测
1.8.4 体外亲和纯化标签蛋白质
1.9 体外磷酸化实验
1.9.1 试剂和材料
1.9.2 步骤
1.10 荧光定量分析基因相对表达
1.10.1 RNA提取
1.10.2 RNA反转录c DNA
1.10.3 q RT-PCR反应
1.10.4 q RT-PCR数据分析
1.11 活性氧测定
1.11.1 试剂及材料
1.11.2 步骤
1.12 胼胝体沉淀染色
1.12.1 试剂和材料
1.12.2 实验步骤
第三章 结果与分析
1.鉴定与LYK5互作的蛋白
2.CPK5缺失突变影响几丁质引起的免疫反应
3.几丁质受体LYK5和LYK4 胞内结构域受CPK5和CPK6 磷酸化调控
4.CPK5 磷酸化LYK5 胞内结构域位点的鉴定
5.LYK5磷酸化位点突变体表型鉴定
6.CPK5 稳定CERK1 蛋白水平的研究
第四章 讨论
参考文献
附录一 本课题所用引物序列
附录二
附录三 在读期间发表论文
致谢
本文编号：3812094
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3812094.html
最近更新
教材专著
