象耳豆根结线虫mapk基因和cbp基因的克隆与RNAi效应分析

发布时间：2023-05-21 19:52

　　象耳豆根结线虫(Meloidogyne enterolobii)在美洲、非洲、欧洲等均有分布,是世界上公认的危害最大的根结线虫之一。近年来我国热带、亚热带地区相继报道象耳豆根结线虫危害日趋严重,甚至有取代南方根结线虫(Mincognita),而成为我国热带亚热带地区最重要根结线虫种类的趋势。然而,相比其他线虫如模式线虫秀丽小杆线虫(Caenorhabdits elegans)、北方根结线虫(M.hapla)和南方根结线虫(Mincognita),至目前对象耳豆根结线虫功能基因组的研究较少,关于其功能基因的分子生物学基础的报道更是罕见。本研究以M enterolobii为对象,根据本实验室前期已获得的cDNA文库序列信息,结合RACE技术,克隆到了促分裂原活化蛋白激酶基因(Me-mapk-1)和纤维素结合蛋白基因(Me-cbp-1)cDNA的全长序列,并分别对其进行了生物信息学分析以及RNAi效应分析。Me-mapk-1 cDNA全长序列为1369 bp,包含长度为27 bp的5’非编码区、157 bp的3’非编码区(包括24个碱基polyA尾巴)和一个1185 bp的开放阅读框(ORF...

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摘要
Abstract
1 引言
    1.1 根结线虫简介
        1.1.1 根结线虫致病机理
        1.1.2 根结线虫防治研究
    1.2 象耳豆根结线虫研究进展
        1.2.1 象耳豆根结线虫的发生与分布
        1.2.2 象耳豆根结线虫的生活史
        1.2.3 象耳豆根结线虫分类地位及形态特征
    1.3 植物寄生线虫促分裂原活化蛋白激酶研究进展
        1.3.1 促分裂原活化蛋白激酶基因简介
        1.3.2 植物寄生线虫促分裂原活化蛋白激酶基因的结构及编码蛋白特点
        1.3.3 MAPK通路研究展望
    1.4 植物寄生线虫纤维素结合蛋白研究进展
        1.4.1 纤维素结合蛋白基因简介
        1.4.2 植物寄生线虫纤维素结合蛋白基因的结构及编码蛋白特点
        1.4.3 植物寄生线虫纤维素结合蛋白基因表达分析
    1.5 植物寄生线虫RNAi研究进展
    1.6 本研究的目的和意义
    1.7 研究的技术路线
2 材料和方法
    2.1 供试线虫
    2.2 主要耗材与仪器
    2.3 主要配制试剂
    2.4 Me-mapk-1 cDNA第一链合成
        2.4.1 象耳豆根结线虫J2总RNA提取
        2.4.2 cDNA第一链合成
    2.5 RACE获Me-mapk-1的全长
        2.5.1 mapk引物设计与合成
        2.5.2 RACE模板的获得
        2.5.3 MAPK基因cDNA 3'末端扩增
        2.5.4 产物的回收
        2.5.5 连接至T载体及转化
        2.5.6 MAPK基因cDNA 5'末端扩增
        2.5.7 MAPK全长序列的克隆
    2.6 象耳豆根结线虫MAPK基因的原核表达
        2.6.1 目的基因片段扩增
        2.6.2 提取和鉴定质粒DNA
        2.6.3 表达重组子pET-32a-mapk的建立
        2.6.4 连接产物的转化以及筛选阳性克隆
        2.6.5 提取pET-32a-MAPK质粒转入大肠杆菌BL21
        2.6.6 Me-MAPK的诱导表达
        2.6.7 表达产物的SDS-PAGE电泳检测
    2.7 象耳豆根结线虫MAPK基因的RNAi分析
        2.7.1 引物设计
        2.7.2 线虫总RNA提取和cDNA获得
        2.7.3 Me-mapk-1特异靶标序列的获得
        2.7.4 dsRNA的合成
        2.7.5 Me-mapk-1的RNAi分析
        2.7.6 侵染力分析
    2.8 RACE获Me-cbp-1基因的全长的克隆
        2.8.1 引物设计
        2.8.2 Me-cbp-1基因3'和5末端的扩增
        2.8.3 Me-cbp-1 cDNA全长扩增
    2.9 Me-CBP-1的原位杂交
        2.9.1 标记探针
        2.9.2 杂交前处理
        2.9.3 预杂交和杂交
        2.9.4 显色观察
    2.10 象耳豆根结线虫cbp基因的RNAi分析
        2.10.1 引物设计
        2.10.2 线虫总RNA提取和cDNA的获得
        2.10.3 Me-cbp-1特异靶标序列获得
        2.10.4 dsRNA的合成
        2.10.5 Me-cbp-1的RNAi分析
        2.10.6 侵染力分析
3 结果与分析
    3.1 总RNA提取
    3.2 Me-mapk-1基因3'和5'末端的克隆
    3.3 ME-MAPK-1蛋白序列特征及结构与功能预测
    3.4 ME-MAPK1重组蛋白诱导表达
    3.5 Me-mapk-1 RNAi效应分析
    3.6 Me-mapk-1 RNAi效应表型分析
    3.7 Me-cbp-1 cDNA序列
    3.8 Me-CBP-1蛋白序列特征与结构功能预测
    3.9 Me-cbp-1组织表达定位
    3.10 Me-cbp-1 dsRNA沉默
    3.11 Me-cbp-1 RNAi效应分析
4 讨论
    4.1 M. enterolobii的mapk基因
    4.2 M. enterolobii的cbp基因
5 结论
参考文献
缩略表
附录
致谢



本文编号：3821346