蛋白激发子BcGs1激发番茄抗病性的免疫调控机制研究

发布时间：2023-08-07 17:06

　　BcGs1是作者实验室从灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)代谢物中分离的细胞壁降解酶,能激发番茄和烟草一系列免疫防御反应,提高番茄和烟草的抗病性。为了进一步明确激发子BcGs1激发植物免疫的调控机制,本文对分离纯化得到的BcGs1进行体外糖苷酶活性检测,并进行了诱导番茄抗灰霉病最佳时间的生物学测定,通过蛋白瞬时表达和原核表达对BcGs1的不同功能域进行了激发子活性鉴定。采用蛋白质组学技术分析了BcGs1诱导番茄后显著性差异表达的蛋白,同时结合荧光定量PCR验证、ROS积累、酶活性检测以及组织细胞学观察,阐述了激发子BcGs1诱导番茄抗病性的机制。具体结果如下:1.分离纯化的激发子BcGs1诱导番茄后,能够引起细胞的快速坏死;显著提高番茄对灰葡萄孢菌的抗性。BcGs1渗入番茄,烟草,豌豆和黄瓜叶片组织12-24 h,能引起这些寄主细胞坏死,说明BcGs1能激发寄主细胞坏死。以最低诱导浓度0.25μM BcGs1处理番茄植株后72 h接种灰葡萄孢菌,侵染面积比对照减少了23.3%。2.BcGs1具有糖苷酶活性,能水解淀粉和海带多糖,但不能水解羟甲基纤维素和微晶纤维素。BcGs1...

【文章页数】：68 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 激发子的研究现状
    1.2 激发子诱导植物免疫反应模式
    1.3 激发子诱导植物获得抗病性的机制
    1.4 细胞壁降解酶类激发子的研究进展
    1.5 ITRAQ技术
    1.6 灰葡萄孢菌与植物互作特性
    1.7 BCGS1研究背景
    1.8 研究的目的和意义
    1.9 技术路线
第二章 BcGs1诱导番茄对灰霉病的抗病性
    2.1 实验材料
        2.1.1 试验菌株
        2.1.2 实验仪器与试剂
        2.1.3 数据分析工具与方法
    2.2 蛋白 BcGs1 的制备与活性检测
    2.3 蛋白浓度检测
    2.4 BCGS1诱导番茄对灰葡萄孢菌的抗性测定
    2.5 结果与分析
        2.5.1 BcGs1蛋白纯化与活性检测
        2.5.2 BcGs1诱导番茄抗病性最佳诱导时间
    2.6 结果与讨论
第三章 蛋白BcGs1的糖苷酶活性及功能域鉴定
    3.1 实验材料
        3.1.1 仪器和试剂
        3.1.2 菌株与载体
        3.1.3 培养基与试剂配方
    3.2 实验方法
        3.2.1 BcGs1酶活性检测
        3.2.2 葡萄糖标准曲线的绘制
        3.2.3 BcGs1蛋白的酶活性测定
        3.2.4 瞬时表达载体的构建
        3.2.5 原核表达体系的构建
    3.3 结果与分析
        3.3.1 蛋白BcGs1酶活性检测
        3.3.2 构建了蛋白BcGs1、GH15、CBM20的瞬时表达载体
        3.3.3 不同蛋白瞬时表达与Western blot验证
        3.3.4 成功构建pET-30a-GH15原核表达载体
        3.3.5 蛋白GH15表达纯化和Western blot检测
        3.3.6 GH15蛋白活性检测
    3.4 小结与讨论
第四章 BcGs1诱导番茄抗病性的蛋白质组学分析
    4.1 实验材料
        4.1.1 供试植株
        4.1.2 仪器与试剂
        4.1.3 数据分析
    4.2 实验方法
        4.2.1 实验流程图
        4.2.2 蛋白提取
        4.2.3 蛋白定量检测
        4.2.4 蛋白SDS-PAGE电泳
        4.2.5 蛋白Trypsin酶解
        4.2.6 肽段标记和等量混合
        4.2.7 蛋白highPH-RP分级
        4.2.8 蛋白质谱分析
        4.2.9 数据分析
    4.3 结果与分析
        4.3.1 蛋白定量分析
        4.3.2 常规HPLC分离
        4.3.4 蛋白质鉴定结果
        4.3.5 定量差异蛋白分析
        4.3.6 GO功能富集分析
        4.3.7 KEGG代谢通路分析
    4.4 小结与讨论
第五章 BcGs1诱导番茄抗病差异蛋白基因转录表达分析及防御物质积累
    5.1 实验材料
        5.1.1 供试植株
        5.1.2 仪器与试剂
        5.1.3 分析与设计软件
    5.2 实验方法
        5.2.1 特异性引物设计
        5.2.2 BcGs1处理番茄植株
        5.2.3 BcGs1处理番茄样品总RNA提取
        5.2.4 cDNA第一链的合成
        5.2.5 目的基因qPCR扩增
        5.2.6 荧光定量PCR结果分析
    5.3 早期防御反应检测
        5.3.1 H2O2生成及含量检测
        5.3.2 BcGs1诱导的关键酶PAL和POD含量检测
        5.3.3 BcGs1诱导番茄木质素生成
    5.4 结果与分析
        5.4.1 番茄样品总RNA提取
        5.4.2 BcGs1诱导番茄抗性差异蛋白相关基因转录分析
        5.4.3 BcGs1诱导番茄叶片H2O2积累
        5.4.4 BCGS1诱导番茄组织中防御关键酶的活性
        5.4.5 BcGs1诱导番茄细胞木质素积累
        5.4.6 BcGs1诱导番茄细胞壁增厚
    5.5 小结与讨论
第六章 全文结论
参考文献
致谢
作者简历



本文编号：3840018