油菜与核盘菌互作的组学解析
发布时间：2023-10-04 04:29
油菜(Brassica napus)是我国主要的油料作物之一,由死体营养型病原真菌核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)所致的油菜菌核病是对我国油菜生产危害最大的病害。但是,油菜抗菌核病资源缺乏,对油菜与核盘菌互作的机制研究还不够深入,抗核盘菌相关的调控因子亟待鉴定。因此,利用油菜基因组得到测定和解析的契机,本研究组合采用sRNA组、转录组、蛋白质组以及磷酸化蛋白质组等功能组学技术,对油菜与核盘菌互作机理进行组学解析,获得了以下主要结果:(1)开展了油菜与核盘菌互作的miRNA组学分析,揭示了 miRNA和AGO介导的RNA沉默对油菜与核盘菌互作的重要调控作用。通过高通量测序,鉴定得到油菜227个保守miRNA和53个新miRNA,并通过降解组测序鉴定了其中237个miRNA的靶基因。采用miRNA芯片分析鉴定获得68个响应核盘菌侵染的miRNAs,其中一组靶标植物防卫反应相关基因,包括NBS-LRR类抗病基因以及一氧化氮和活性氧相关基因。还有三个miRNA分别靶标RNA沉默核心基因AGO1和AGO2。瞬时表达RNA沉默抑制子减弱了植株对核盘菌的抗性。拟南芥ago1...
【文章页数】：241 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
致谢
摘要
Abstract
第一章 研究背景
1.1 核盘菌与油菜菌核病
1.1.1 核盘菌的生物学特性及危害
1.1.2 核盘菌的重要致病因子及致病机理研究进展
1.1.3 油菜抗菌核病研究进展
1.2 RNA沉默及其在植物-病原物互作中的调控功能
1.2.1 RNA沉默的机理
1.2.2 RNA沉默通路关键蛋白及其在植物-病原物互作中的调控功能
1.2.3 植物miRNA及其抗病调控功能研究进展
1.3 组学技术在植物抗病研究中的应用
1.3.1 转录组研究技术
1.3.2 sRNA组研究技术
1.3.3 蛋白质组研究技术
1.4 本研究的目的和内容
第二章 油菜与核盘菌互作相关microRNAs的组学鉴定及功能分析
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.2 sRNA文库的构建和Illumina深度测序
2.1.3 测序数据分析
2.1.4 降解组文库构建及数据分析
2.1.5 miRNA芯片表达谱分析
2.1.6 实时荧光定量PCR分析
2.1.7 MicroRNA靶基因5'RACE验证分析
2.1.8 沉默抑制子功能分析
2.1.9 MicroRNA瞬时超表达
2.2 结果与分析
2.2.1 油菜sRNA高通量测序基本数据的获得
2.2.2 油菜中已知以及保守miRNA的鉴定
2.2.3 油菜中新发现的miRNA的鉴定获得
2.2.4 利用降解组测序鉴定miRNA靶基因
2.2.5 油菜中抗核盘菌相关的miRNA的鉴定
2.2.6 抗核盘菌相关油菜miRNA及其靶基因的验证
2.2.7 沉默抑制子的功能研究结果证明了RNA沉默在抗核盘菌中的作用
2.2.8 瞬时超表达靶标AGO1和AGO2的miRNA降低了AGO1和AGO2的表达水平,同时增加了油菜对核盘菌的敏感性
2.2.9 拟南芥ago2-1突变体表现比野生型更高的核盘菌敏感性
2.3 讨论
2.3.1 油菜miRNA及其靶标的鉴定
2.3.2 参与油菜与核盘菌互作的miRNA
第三章 油菜RNAi通路关键基因家族的组学鉴定及其抗病调控功能分析
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因家族的鉴定及系统进化分析
3.1.3 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因家族的系统进化分析和命名
3.1.4 基因结构分析以及启动子区顺式作用元件预测
3.1.5 RNA提取及反转录
3.1.6 实时荧光定量PCR分析
3.1.7 油菜CAMTA3蛋白CG1结构域原核表达及纯化
3.1.8 凝胶阻滞分析(EMSA)
3.2 结果与分析
3.2.1 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因的鉴定及分析
3.2.2 DCLs、AGOs和RDRs基因的进化树分析
3.2.3 DCLs、AGOs和RDRs蛋白的理化特性和结构域组成分析
3.2.4 DCLs、AGOs和RDRs家族的基因结构分析以及顺式作用元件预测
3.2.5 组成性和核盘菌接种条件下BnDCLs、BnAGOs、BnRDRs和BnCAMTA3s的表达分析
3.2.6 凝胶阻滞分析(EMSA)证明BnCAMTA3与部分BnDCL、BnAGO以及BnRDR家族基因互作
3.2.7 拟南芥dcl、ago和rdr突变体植株普遍表现出对核盘菌敏感性的改变
3.3 讨论
3.3.1 油菜中的基因沉默机制
3.3.2 RNA沉默在植物抗真菌病害中的作用
3.3.3 CAMTA3对RNA沉默的调控
第四章 AGO2调控核盘菌抗性的组学分析
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 测序样品准备
4.1.3 转录组测序
4.1.4 sRNA组测序
4.1.5 实时荧光定量PCR分析
4.2 结果与分析
4.2.1 转录组测序结果分析
4.2.2 sRNA组测序分析
4.2.3 转录组测序和sRNA测序的联合分析
4.2.4 荧光定量PCR验证差异表达mRNA和miRNA
4.2.5 拟南芥gstu2、gstu5以及rbohf突变体植株对核盘菌的抗病性分析
4.3 讨论
第五章 油菜与核盘菌互作的定量蛋白组学分析
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 样品准备
5.1.3 油菜叶片的DAB染色观察
5.1.4 油菜叶片蛋白质的提取以及浓度测定
5.1.5 蛋白质的酶解
5.1.6 肽段的TMT标记
5.1.7 标记后肽段的脱盐
5.1.8 质谱分析
5.1.9 实时荧光定量PCR分析
5.2 结果与分析
5.2.1 油菜接种核盘菌后的症状观察以及ROS产生情况检测
5.2.2 响应不同核盘菌菌株的定量蛋白质组学分析
5.2.3 油菜响应不致病的核盘菌突变体菌株Ep-1PB的蛋白质组
5.2.4 油菜响应核盘菌野生型菌株1980的蛋白质组
5.2.5 油菜响应野生型菌株1980和不致病菌株Ep-1PB的蛋白质组的比较分析
5.2.6 对野生型菌株1980和不致病菌株Ep-1PB差异响应的油菜蛋白的互作关系
5.2.7 采用qRT-PCR分析验证了通过蛋白质组学分析获得的差异表达蛋白
5.3 讨论
第六章 油菜响应核盘菌的磷酸化蛋白质组分析
6.1 材料与方法
6.1.1 材料
6.1.2 样品准备
6.1.3 油菜叶片蛋白质的提取以及浓度测定
6.1.4 蛋白质的酶解
6.1.5 磷酸化肽富集
6.1.6 肽段的脱盐
6.1.7 质谱分析
6.1.8 磷酸化蛋白质的鉴定
6.2 结果与分析
6.2.1 磷酸化蛋白、肽段、位点的整体情况
6.2.2 差异表达磷酸化蛋白的鉴定
6.2.3 磷酸化蛋白与全蛋白比较
6.3 讨论
第七章 全文小结与研究展望
7.1 全文小结
7.2 研究展望
参考文献
附录 附表以及论文相关缓冲液和培养基配方
本文编号：3851317
【文章页数】：241 页
【学位级别】：博士
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致谢
摘要
Abstract
第一章 研究背景
1.1 核盘菌与油菜菌核病
1.1.1 核盘菌的生物学特性及危害
1.1.2 核盘菌的重要致病因子及致病机理研究进展
1.1.3 油菜抗菌核病研究进展
1.2 RNA沉默及其在植物-病原物互作中的调控功能
1.2.1 RNA沉默的机理
1.2.2 RNA沉默通路关键蛋白及其在植物-病原物互作中的调控功能
1.2.3 植物miRNA及其抗病调控功能研究进展
1.3 组学技术在植物抗病研究中的应用
1.3.1 转录组研究技术
1.3.2 sRNA组研究技术
1.3.3 蛋白质组研究技术
1.4 本研究的目的和内容
第二章 油菜与核盘菌互作相关microRNAs的组学鉴定及功能分析
2.1 材料与方法
2.1.1 材料
2.1.2 sRNA文库的构建和Illumina深度测序
2.1.3 测序数据分析
2.1.4 降解组文库构建及数据分析
2.1.5 miRNA芯片表达谱分析
2.1.6 实时荧光定量PCR分析
2.1.7 MicroRNA靶基因5'RACE验证分析
2.1.8 沉默抑制子功能分析
2.1.9 MicroRNA瞬时超表达
2.2 结果与分析
2.2.1 油菜sRNA高通量测序基本数据的获得
2.2.2 油菜中已知以及保守miRNA的鉴定
2.2.3 油菜中新发现的miRNA的鉴定获得
2.2.4 利用降解组测序鉴定miRNA靶基因
2.2.5 油菜中抗核盘菌相关的miRNA的鉴定
2.2.6 抗核盘菌相关油菜miRNA及其靶基因的验证
2.2.7 沉默抑制子的功能研究结果证明了RNA沉默在抗核盘菌中的作用
2.2.8 瞬时超表达靶标AGO1和AGO2的miRNA降低了AGO1和AGO2的表达水平,同时增加了油菜对核盘菌的敏感性
2.2.9 拟南芥ago2-1突变体表现比野生型更高的核盘菌敏感性
2.3 讨论
2.3.1 油菜miRNA及其靶标的鉴定
2.3.2 参与油菜与核盘菌互作的miRNA
第三章 油菜RNAi通路关键基因家族的组学鉴定及其抗病调控功能分析
3.1 材料与方法
3.1.1 材料
3.1.2 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因家族的鉴定及系统进化分析
3.1.3 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因家族的系统进化分析和命名
3.1.4 基因结构分析以及启动子区顺式作用元件预测
3.1.5 RNA提取及反转录
3.1.6 实时荧光定量PCR分析
3.1.7 油菜CAMTA3蛋白CG1结构域原核表达及纯化
3.1.8 凝胶阻滞分析(EMSA)
3.2 结果与分析
3.2.1 油菜DCLs、AGOs和RDRs基因的鉴定及分析
3.2.2 DCLs、AGOs和RDRs基因的进化树分析
3.2.3 DCLs、AGOs和RDRs蛋白的理化特性和结构域组成分析
3.2.4 DCLs、AGOs和RDRs家族的基因结构分析以及顺式作用元件预测
3.2.5 组成性和核盘菌接种条件下BnDCLs、BnAGOs、BnRDRs和BnCAMTA3s的表达分析
3.2.6 凝胶阻滞分析(EMSA)证明BnCAMTA3与部分BnDCL、BnAGO以及BnRDR家族基因互作
3.2.7 拟南芥dcl、ago和rdr突变体植株普遍表现出对核盘菌敏感性的改变
3.3 讨论
3.3.1 油菜中的基因沉默机制
3.3.2 RNA沉默在植物抗真菌病害中的作用
3.3.3 CAMTA3对RNA沉默的调控
第四章 AGO2调控核盘菌抗性的组学分析
4.1 材料与方法
4.1.1 材料
4.1.2 测序样品准备
4.1.3 转录组测序
4.1.4 sRNA组测序
4.1.5 实时荧光定量PCR分析
4.2 结果与分析
4.2.1 转录组测序结果分析
4.2.2 sRNA组测序分析
4.2.3 转录组测序和sRNA测序的联合分析
4.2.4 荧光定量PCR验证差异表达mRNA和miRNA
4.2.5 拟南芥gstu2、gstu5以及rbohf突变体植株对核盘菌的抗病性分析
4.3 讨论
第五章 油菜与核盘菌互作的定量蛋白组学分析
5.1 材料与方法
5.1.1 材料
5.1.2 样品准备
5.1.3 油菜叶片的DAB染色观察
5.1.4 油菜叶片蛋白质的提取以及浓度测定
5.1.5 蛋白质的酶解
5.1.6 肽段的TMT标记
5.1.7 标记后肽段的脱盐
5.1.8 质谱分析
5.1.9 实时荧光定量PCR分析
5.2 结果与分析
5.2.1 油菜接种核盘菌后的症状观察以及ROS产生情况检测
5.2.2 响应不同核盘菌菌株的定量蛋白质组学分析
5.2.3 油菜响应不致病的核盘菌突变体菌株Ep-1PB的蛋白质组
5.2.4 油菜响应核盘菌野生型菌株1980的蛋白质组
5.2.5 油菜响应野生型菌株1980和不致病菌株Ep-1PB的蛋白质组的比较分析
5.2.6 对野生型菌株1980和不致病菌株Ep-1PB差异响应的油菜蛋白的互作关系
5.2.7 采用qRT-PCR分析验证了通过蛋白质组学分析获得的差异表达蛋白
5.3 讨论
第六章 油菜响应核盘菌的磷酸化蛋白质组分析
6.1 材料与方法
6.1.1 材料
6.1.2 样品准备
6.1.3 油菜叶片蛋白质的提取以及浓度测定
6.1.4 蛋白质的酶解
6.1.5 磷酸化肽富集
6.1.6 肽段的脱盐
6.1.7 质谱分析
6.1.8 磷酸化蛋白质的鉴定
6.2 结果与分析
6.2.1 磷酸化蛋白、肽段、位点的整体情况
6.2.2 差异表达磷酸化蛋白的鉴定
6.2.3 磷酸化蛋白与全蛋白比较
6.3 讨论
第七章 全文小结与研究展望
7.1 全文小结
7.2 研究展望
参考文献
附录 附表以及论文相关缓冲液和培养基配方
本文编号：3851317
本文链接：https://www.wllwen.com/nykjlw/dzwbhlw/3851317.html
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