棉铃虫中肠特异性结合蛋白ABCC1对Cry2Ab、Cry1Ac毒力的影响

发布时间：2023-10-21 14:12

　　昆虫中肠BBMV上的特异性受体蛋白与Bt蛋白结合是Bt发挥杀虫作用的关键,而且特异性受体蛋白发生基因突变或表达量显著改变都可能会使昆虫对Bt产生抗性。已有研究结果表明ABC转运蛋白家族不仅是Cry1A类蛋白的受体,而且ABC转运蛋白的突变与害虫对Bt产生抗性相关。本文在获得了棉铃虫ABCC1基因全长的基础上,对ABCC1在棉铃虫不同组织、不同龄期中的表达量、ABCC1与Cry2Ab、Cry1Ac在体外结合特性及ABCC1对Cry2Ab、Cry1Ac毒力的影响等进行了研究。研究结果可为明确棉铃虫ABCC1蛋白在Cry2Ab、Cry1Ac杀虫机制中的作用、为合理应用Cry2Ab、Cry1Ac用于棉铃虫的防治及延缓棉铃虫抗性发展提供理论依据。主要研究结果如下:1.利用PCR结合RACE-PCR克隆了棉铃虫ABCC1基因全长,并进行了生物信息学分析。ABCC1基因开放阅读框共4545bp,基因登录号:Gen Bank KY 796050。共编码1515个氨基酸,预测蛋白质的相对分子量169.75 k Da,等电点6.68;N末端不存在信号肽;有两个较大的膜外区域,有14个跨膜结构;含两个跨膜结...

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【学位级别】：硕士

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摘要
abstract
第一章 引言
    1.1 棉铃虫危害情况概述
    1.2 Bt菌简介
        1.2.1 Bt蛋白
        1.2.2 Bt蛋白的杀虫过程
    1.3 Bt蛋白受体概述
        1.3.1 钙黏蛋白(CAD)
        1.3.2 碱性磷酸酯酶(ALP)
        1.3.3 氨肽酶(APN)
        1.3.4 三磷酸腺苷结合盒转运蛋白(ABC转运蛋白)
        1.3.5 其他受体蛋白
    1.4 Bt蛋白的抗性产生的原因
    1.5 Cry1A和 Cry2A类蛋白受体研究概况
    1.6 Bt抗性治理策略
    1.7 本研究的内容、目的和意义
第二章 棉铃虫ABCC1 基因克隆及序列分析
    2.1 材料与方法
        2.1.1 供试昆虫
        2.1.2 主要试剂和仪器
        2.1.3 棉铃虫中肠RNA的提取
        2.1.4 棉铃虫中肠cDNA的合成
        2.1.5 3′RACE及5′RACE模板的合成
        2.1.6 引物的设计与合成
        2.1.7 普通PCR反应体系及条件
        2.1.8 PCR产物的回收、转化和测序鉴定
        2.1.9 ABCC1 序列分析和系统发育树的构建
    2.2 结果分析
        2.2.1 普通PCR及 RACE-PCR结果
        2.2.2 ABCC1 序列分析
        2.2.3 ABCC1 序列进化树分析
    2.3 讨论
第三章 棉铃虫ABCC1 基因在不同龄期和组织中的表达量
    3.1 材料方法
        3.1.1 供试昆虫
        3.1.2 主要试剂和仪器
        3.1.3 取样与方法
        3.1.4 RNA的提取及cDNA第一链的合成
        3.1.5 荧光定量PCR分析
        3.1.6 数据处理
    3.2 结果与分析
        3.2.1 不同龄期棉铃虫ABCC1 在转录水平的表达量
        3.2.2 棉铃虫幼虫不同组织中ABCC1 在转录水平的表达量
    3.3 讨论
第四章 ABCC1 跨膜区原核表达及结合能力分析
    4.1 材料与方法
        4.1.1 供试昆虫
        4.1.2 主要试剂
        4.1.3 仪器设备
        4.1.4 RNA的提取及cDNA的合成
        4.1.5 PCR扩增两个跨膜区(TMD1、TMD2)
        4.1.6 PCR产物的回收、转化和测序鉴定
        4.1.7 双酶切及重组表达载体构建
        4.1.8 转化及阳性克隆鉴定
        4.1.9 ABCC1 跨膜区片段的原核表达
        4.1.10 SDS-PAGE电泳及凝胶染色
        4.1.11 ABCC1 跨膜区片段的纯化
        4.1.12 Ligand blot检测
    4.2 结果与分析
        4.2.1 棉铃虫ABCC1 两个跨膜区蛋白原核表达结果
        4.2.2 Ligand blot实验结果分析
    4.3 讨论
第五章 棉铃虫ABCC1 基因的功能研究
    5.1 材料与方法
        5.1.1 供试昆虫
        5.1.2 供试试剂与仪器设备
        5.1.3 合成siRNA及稀释备用
        5.1.4 注射siRNA及基因干扰效率的检测
        5.1.5 基因干扰后的生物测定
        5.1.6 Sf9 昆虫细胞培养
        5.1.7 Cry2Ab、Cry1Ac细胞生测蛋白制备
        5.1.8 pAc-ABCC1 重组质粒的构建
        5.1.9 细胞转染及细胞生测
    5.2 结果与分析
        5.2.1 qPCR检测注射后的干扰效率
        5.2.2 ABCC1 基因沉默后对棉铃虫Cry2Ab、Cry1Ac蛋白敏感性的变化
        5.2.3 细胞转染后ABCC1 基因的PCR检测
        5.2.4 细胞转染后对Cry2Ab蛋白敏感性的变化
    5.3 讨论
第六章 Cry1Ac抗性棉铃虫与敏感棉铃虫ABCC1 基因的比较
    6.1 材料与方法
        6.1.1 供试昆虫
        6.1.2 供试试剂与仪器设备
        6.1.3 氨基酸序列对比分析
        6.1.4 在棉铃虫抗感品系中ABCC1 表达量差异分析
    6.2 结果与分析
        6.2.1 ABCC1 基因在抗性及敏感棉铃虫品系中编码区氨基酸序列比对
        6.2.2 在棉铃虫抗感品系中ABCC1 表达量差异分析结果
    6.3 讨论
第七章 全文总结
    7.1 主要结论
    7.2 创新点
    7.3 问题和展望
参考文献
致谢
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本文编号：3855992