莲草直胸跳甲气味结合蛋白OBPs的克

发布时间：2023-12-24 15:35

　　[目的]昆虫通过灵敏而特异的嗅觉感知周围环境中的挥发性化学信息物质实现对寄主植物的识别和定位、配偶和产卵场所的选择等。莲草直胸跳甲Agasicles hygrphila是全球性恶性杂草喜旱莲子草Alternanthera philoxeroides的专食性天敌。嗅觉是莲草直胸跳甲专一性识别寄主植物的关键。气味结合蛋白(odorant-binding proteins,OBPs)是参与环境中化学信息物质识别的重要嗅觉相关蛋白。通过异源表达获得莲草直胸跳甲的OBPs有助于研究其对喜旱莲子草的识别和定位进而实现寄主专一性。[方法]通过基因克隆获得三个OBP的全长序列,原核表达获得莲草直胸跳甲OBPs的包涵体蛋白。通过Ni-IDA亲和层析进行纯化,得到可溶的目的蛋白。采用ExPASy-ProtParam对蛋白质的理化性质进行分析,利用DNAMAN对蛋白质进行多序列比对,利用MEGA5.02采用NJ法构建了莲草直胸跳甲OBPs的进化树。采用qPCR对莲草直胸跳甲OBPs在雌雄成虫不同组织和不同组织同一性别的成虫中的表达量进行测定,采用SPSS 22.0进行数据统计分析,分别采用One-way A...

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【学位级别】：硕士

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摘要
1 引言
    1.1 昆虫的嗅觉
    1.2 昆虫的嗅觉机制
    1.3 植物挥发物和昆虫信息素
        1.3.1 植物挥发物
        1.3.2 昆虫信息素
    1.4 气味结合蛋白(OBPs)的研究进展
        1.4.1 OBPs的发现
        1.4.2 OBPs的特征
        1.4.3 OBPs的分类
        1.4.4 OBPs的生理功能
        1.4.5 OBPs在其他组织器官中的表达
        1.4.6 OBPs与配体的结合特性
        1.4.7 OBPs与配体结合的研究方法
    1.5 其他嗅觉相关蛋白
    1.6 研究目的及意义
2 莲草直胸跳甲OBPs的基因克隆、原核表达及纯化分析
    2.1 材料和方法
        2.1.1 供试昆虫
        2.1.2 实验试剂
        2.1.3 实验仪器
        2.1.4 所用载体
        2.1.5 所配试剂
    2.2 试验方法
        2.2.1 莲草直胸跳甲总RNA的提取
        2.2.2 反转录cDNA的合成
        2.2.3 目的序列的PCR扩增
        2.2.4 PCR产物胶回收
        2.2.5 克隆型载体的构建
        2.2.6 转化
        2.2.7 阳性重组子的鉴定、测序和保存
    2.3 莲草直胸跳甲OBPs生物信息学分析
    2.4 莲草直胸跳甲OBPs的表达模式分析
        2.4.1 供试昆虫及组织收集
        2.4.2 莲草直胸跳甲各组织总RNA的提取
        2.4.3 cDNA第一条链的合成
        2.4.4 引物设计
        2.4.5 实时荧光定量PCR反应
    2.5 莲草直胸跳甲OBPs原核表达载体的构建
        2.5.1 pEASY(?)- Blunt Cloning Vector质粒提取
        2.5.2 表达引物的设计
        2.5.3 表达序列PCR
        2.5.4 PCR产物回收
        2.5.5 转化
        2.5.6 pET28a(+)质粒提取
        2.5.7 pET28a(+)双酶切
        2.5.8 无缝克隆
        2.5.9 转化
        2.5.10 阳性克隆鉴定
    2.6 莲草直胸跳甲OBPs的表达、纯化
        2.6.1 IPTG诱导蛋白表达
        2.6.2 SDS-PAGE检测蛋白表达
        2.6.3 原核表达蛋白的纯化
3 结果与分析
    3.1 目的序列扩增结果
    3.2 目的序列克隆载体构建结果
    3.3 莲草直胸跳甲OBPs的生物信息学分析结果
        3.3.1 莲草直胸跳甲OBPs的理化性质分析
        3.3.2 莲草直胸跳甲OBPs的多序列比对
        3.3.3 莲草直胸跳甲OBPs的进化树分析
    3.4 表达模式分析
    3.5 目的序列原核表达载体构建结果
        3.5.1 目的序列表达引物PCR结果
        3.5.2 目的序列重组表达载体的鉴定
    3.6 目的蛋白原核表达及蛋白纯化结果
        3.6.1 目的蛋白的诱导表达
        3.6.2 AhygOBP1的蛋白经不同浓度洗杂缓冲液纯化
        3.6.3 AhygOBP1的蛋白纯化
4 结论
5 讨论
参考文献
Abstract
致谢



本文编号：3874799