苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒GP64蛋白的结构与功能关系研究
发布时间：2024-01-11 07:59
杆状病毒是一类感染昆虫的双链大分子DNA病毒,通常产生出芽型病毒(budded virions,BV)和包涵型病毒(occlusion-derived virions,ODV)两类形态不同的病毒粒子。苜蓿丫纹夜蛾核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus,AcMNPV)BV的主要囊膜蛋白GP64属于第三类病毒膜融合蛋白家族,该家族代表性成员还包括水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus,VSV)G蛋白和单纯疱疹病毒(herpes simplex virus type 1,HSV-1)gB等。目前,已解析的AcMNPV GP64在低pH条件下的三级结构包含五个结构域(domain I-V,简称DI-DV),但其中性pH条件下的三级结构以及低pH诱导的构象变化分子机制尚不清楚。本文针对AcMNPV GP64的DI与DV之间可能的相互作用以及晶体结构仍未被完全解析的DIV开展了结构与功能关系研究,取得的主要结果如下:一、DI与DV的结构与功能关系结构分析表明,GP64 DV与DI中邻近融合...
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 生物学膜融合及病毒膜融合蛋白
1.1.1 生物学膜融合
1.1.2 病毒感染介导的膜融合
1.1.3 病毒膜融合蛋白
1.2 杆状病毒简介
1.2.1 杆状病毒结构类型
1.2.2 杆状病毒分类
1.2.3 杆状病毒粒子
1.2.4 杆状病毒的侵染过程
1.2.5 杆状病毒的感染周期
1.2.6 杆状病毒基因表达时相
1.2.7 杆状病毒主要膜融合蛋白
1.2.8 杆状病毒的应用
1.3 杆状病毒膜融合蛋白GP64 的研究进展
1.3.1 GP64在BV感染过程中的作用
1.3.2 GP64 蛋白的三级结构
1.3.3 GP64 的结构与功能关系
1.4 研究目的及意义
第二章 GP64 结构域Ⅰ与结构域Ⅴ的结构与功能关系分析
2.1 材料与设备
2.1.1 细胞、菌株和质粒
2.1.2 培养基
2.1.3 生化试剂及相关溶液
2.1.4 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
2.2.2 聚合酶链式反应
2.2.3 目的片段的分离回收
2.2.4 限制性内切酶酶切反应
2.2.5 连接反应
2.2.6 化学法转化
2.2.7 克隆子的筛选
2.2.8 质粒DNA的提取
2.2.9 序列测定和分析
2.2.10 甘油菌的保存
2.2.11 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建
2.2.12 瞬时表达质粒转染Sf9 细胞
2.2.13 蛋白质免疫印迹
2.2.14 细胞表面酶联免疫吸附
2.2.15 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算
2.2.16 半融合及融合孔形成检测
2.3 结果
2.3.1 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ的氨基酸特征分析
2.3.2 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体基因的克隆及瞬时表达质粒的构建
2.3.3 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的表达分析
2.3.4 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的细胞表面定位分析
2.3.5 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的膜融合活性分析
2.3.6 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析
2.3.7 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析
2.4 讨论
第三章 GP64 结构域Ⅳ的结构与功能关系分析
3.1 材料和设备
3.1.1 材料及试剂
3.1.2 主要仪器设备
3.2 方法
3.2.1 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建
3.2.2 蛋白免疫印迹
3.2.3 细胞表面酶联免疫吸附
3.2.4 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算
3.2.5 半融合及融合孔形成检测
3.2.6 DH10Bac(gp64ko)感受态细胞的制备
3.2.7 重组病毒bacmid的构建
3.2.8 病毒bacmid的电击转化
3.2.9 病毒bacmid转染Sf9 细胞
3.2.10 病毒感染Sf9 细胞及病毒的扩增
3.2.11 病毒滴度测定
3.2.12 病毒生长曲线测定
3.2.13 病毒与细胞结合及病毒入侵分析
3.2.14 病毒出芽释放分析
3.3 结果
3.3.1 GP64 结构域Ⅳ的氨基酸特征分析
3.3.2 GP64 结构域Ⅳ突变体的克隆及瞬时表达质粒的构建
3.3.3 GP64 突变体蛋白结构域Ⅳ的结构分析
3.3.4 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的表达分析
3.3.5 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的细胞膜表面定位分析
3.3.6 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的膜融合活性分析
3.3.7 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析
3.3.8 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析
3.3.9 表达GP64 及其突变体基因的重组bacmid的构建
3.3.10 GP64 结构域Ⅳ氨基酸突变对BV产生的影响分析
3.3.11 病毒感染条件下GP64 突变体的融合活性及构象变化分析
3.3.12 E390A,G391A,N381/K389A显著影响病毒入侵
3.3.13 E390A,G391A,N381/K389A对病毒释放没有显著影响
3.3.14 GP64 氨基酸保守性替换突变对融合活性及BV产生的影响分析
3.4 讨论
第四章 总结
4.1 主要结论
4.2 展望
4.3 创新点
参考文献
附录1 克隆GP64 突变体的PCR引物
附录2 杆状病毒GP64 氨基酸序列比对
致谢
作者简介
本文编号：3877826
【文章页数】：136 页
【学位级别】：博士
【文章目录】：
摘要
ABSTRACT
第一章 文献综述
1.1 生物学膜融合及病毒膜融合蛋白
1.1.1 生物学膜融合
1.1.2 病毒感染介导的膜融合
1.1.3 病毒膜融合蛋白
1.2 杆状病毒简介
1.2.1 杆状病毒结构类型
1.2.2 杆状病毒分类
1.2.3 杆状病毒粒子
1.2.4 杆状病毒的侵染过程
1.2.5 杆状病毒的感染周期
1.2.6 杆状病毒基因表达时相
1.2.7 杆状病毒主要膜融合蛋白
1.2.8 杆状病毒的应用
1.3 杆状病毒膜融合蛋白GP64 的研究进展
1.3.1 GP64在BV感染过程中的作用
1.3.2 GP64 蛋白的三级结构
1.3.3 GP64 的结构与功能关系
1.4 研究目的及意义
第二章 GP64 结构域Ⅰ与结构域Ⅴ的结构与功能关系分析
2.1 材料与设备
2.1.1 细胞、菌株和质粒
2.1.2 培养基
2.1.3 生化试剂及相关溶液
2.1.4 主要仪器设备
2.2 实验方法
2.2.1 大肠杆菌DH5α感受态细胞的制备
2.2.2 聚合酶链式反应
2.2.3 目的片段的分离回收
2.2.4 限制性内切酶酶切反应
2.2.5 连接反应
2.2.6 化学法转化
2.2.7 克隆子的筛选
2.2.8 质粒DNA的提取
2.2.9 序列测定和分析
2.2.10 甘油菌的保存
2.2.11 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建
2.2.12 瞬时表达质粒转染Sf9 细胞
2.2.13 蛋白质免疫印迹
2.2.14 细胞表面酶联免疫吸附
2.2.15 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算
2.2.16 半融合及融合孔形成检测
2.3 结果
2.3.1 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ的氨基酸特征分析
2.3.2 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体基因的克隆及瞬时表达质粒的构建
2.3.3 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的表达分析
2.3.4 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的细胞表面定位分析
2.3.5 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白的膜融合活性分析
2.3.6 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析
2.3.7 GP64 结构域Ⅰ与 Ⅴ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析
2.4 讨论
第三章 GP64 结构域Ⅳ的结构与功能关系分析
3.1 材料和设备
3.1.1 材料及试剂
3.1.2 主要仪器设备
3.2 方法
3.2.1 GP64 突变体瞬时表达质粒的构建
3.2.2 蛋白免疫印迹
3.2.3 细胞表面酶联免疫吸附
3.2.4 细胞-细胞融合实验及膜融合活性计算
3.2.5 半融合及融合孔形成检测
3.2.6 DH10Bac(gp64ko)感受态细胞的制备
3.2.7 重组病毒bacmid的构建
3.2.8 病毒bacmid的电击转化
3.2.9 病毒bacmid转染Sf9 细胞
3.2.10 病毒感染Sf9 细胞及病毒的扩增
3.2.11 病毒滴度测定
3.2.12 病毒生长曲线测定
3.2.13 病毒与细胞结合及病毒入侵分析
3.2.14 病毒出芽释放分析
3.3 结果
3.3.1 GP64 结构域Ⅳ的氨基酸特征分析
3.3.2 GP64 结构域Ⅳ突变体的克隆及瞬时表达质粒的构建
3.3.3 GP64 突变体蛋白结构域Ⅳ的结构分析
3.3.4 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的表达分析
3.3.5 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的细胞膜表面定位分析
3.3.6 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白的膜融合活性分析
3.3.7 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白诱导半融合及融合孔形成分析
3.3.8 GP64 结构域Ⅳ突变体蛋白在低pH条件下的构象变化分析
3.3.9 表达GP64 及其突变体基因的重组bacmid的构建
3.3.10 GP64 结构域Ⅳ氨基酸突变对BV产生的影响分析
3.3.11 病毒感染条件下GP64 突变体的融合活性及构象变化分析
3.3.12 E390A,G391A,N381/K389A显著影响病毒入侵
3.3.13 E390A,G391A,N381/K389A对病毒释放没有显著影响
3.3.14 GP64 氨基酸保守性替换突变对融合活性及BV产生的影响分析
3.4 讨论
第四章 总结
4.1 主要结论
4.2 展望
4.3 创新点
参考文献
附录1 克隆GP64 突变体的PCR引物
附录2 杆状病毒GP64 氨基酸序列比对
致谢
作者简介
本文编号：3877826
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