ApⅣ 3C蛋白酶抑制剂的虚拟筛选及活性验证

发布时间：2024-03-23 13:29

　　吐白水软化病是柞蚕一种重要的病害,通常发病于辽宁,吉林,黑龙江等天气寒冷的地区。柞蚕患病的机率约为30%,在严重的地域甚至可以超过70%。研究发现,柞蚕Iflavirus病毒(ApIV)是柞蚕吐白水软化病的病原之一,是小RNA病毒科一株单正链RNA病毒。小RNA病毒科病毒的3C蛋白酶具有高度保守的活性位点。3C蛋白酶在病毒复制中有前体蛋白切割的功能,且在宿主细胞内没有同源位点,常被选为研制抗小RNA病毒抑制剂的靶标。对3C蛋白酶已经进行了长期的大量的研究,但是还没有针对ApIV 3C蛋白酶抑制剂的研究。在本论文中,通过同源建模以及分子动力学的方法构建了ApIV 3C蛋白酶的三维结构,通过基于分子对接的虚拟筛选,从含3500多个分子的天然产物数据库中筛选出15个候选化合物,通过体内外的病毒抑制实验,获得异黄酮类化合物Orobol,发现其具有良好的抗ApIV病毒活性。体内实验结果表明,随着Orobol浓度的升高,其抑制病毒复制率越高,当Orobol的浓度达到10μg/ml时,抑制病毒复制率达到80.5%,并且在此浓度下,细胞毒性造成的细胞活性的降低仅为3.42%,细胞毒性低。体内实验通过观...

【文章页数】：82 页

【学位级别】：硕士

【文章目录】：
摘要
Abstract
引言
1 文献综述
    1.1 柞蚕吐白水软化病研究进展
        1.1.1 病症
        1.1.2 病原
        1.1.3 防治药物研究
    1.2 ApIV病毒
        1.2.1 小RNA病毒概述
        1.2.2 ApIV结构及基因组学
        1.2.3 ApIV复制周期
    1.3 3C蛋白酶
        1.3.1 3C蛋白酶的靶标功能
        1.3.2 3C蛋白酶的结构
    1.4 3C蛋白酶抑制剂研究进展
        1.4.1 肽类抑制剂
        1.4.2 非肽类抑制剂
        1.4.3 微生物提取物
    1.5 同源建模基础理论
    1.6 基于分子对接虚拟筛选
        1.6.1 分子对接基础理论
        1.6.2 分子对接分类
    1.7 分子动力学
        1.7.1 分子动力学理论基础
        1.7.2 分子动力学的过程
    1.8 先导化合物优化
    1.9 研究的目的与意义
    1.10 研究内容与技术路线
2 基于分子对接的虚拟筛选
    2.1 引言
    2.2 计算分析软件
    2.3 ApIV 3C蛋白酶的同源建模和模型评估
        2.3.1 同源建模
        2.3.2 模型的评估
        2.3.3 分子动力学模拟
    2.4 基于分子对接的虚拟筛选
        2.4.1 活性位点的选择
        2.4.2 AutoDock 4.2
        2.4.3 LibDock
        2.4.4 CDOCKER
        2.4.5 化合物的类药5规则
    2.5 结果分析
        2.5.1 ApIV 3C蛋白酶的同源建模和模型验证
        2.5.2 基于分子对接的虚拟筛选
    2.6 本章小结
3 化合物的合成与结构鉴定
    3.1 引言
    3.2 实验材料和设备
        3.2.1 菌株
        3.2.2 实验设备
        3.2.3 试剂配置
    3.3 菌株摇瓶发酵研究
        3.3.1 阿维链霉菌的活化
        3.3.2 最佳碳氮源筛选实验
        3.3.3 装液量条件优化
    3.4 Genistei与阿维链霉菌NRRL8165的生物转化
    3.5 代谢产物的分离与结构分析
    3.6 结果分析
        3.6.1 最佳碳氮源筛选结果
        3.6.2 装液量条件优化结果
        3.6.3 Orobol的合成与结构鉴定
    3.7 本章小结
4 化合物的生物活性验证
    4.1 引言
    4.2 实验材料和设备
        4.2.1 化合物、细胞株、病毒、实验动物
        4.2.2 实验试剂
        4.2.3 实验设备
        4.2.4 试剂配制
    4.3 实验方法
        4.3.1 细胞准备
        4.3.2 ApIV病毒的繁殖与提取
        4.3.3 CCK-8 法检测ApIV病毒的TCID50值
        4.3.4 ApIV病毒接种量的优化
        4.3.5 q-PCR法初筛活性化合物
        4.3.6 活性化合物的q-PCR实验验证
        4.3.7 细胞毒性实验
        4.3.8 体内实验
    4.4 实验结果与讨论
        4.4.1 ApIV病毒的TCID50的测定
        4.4.2 ApIV病毒接种量的确定
        4.4.3 q-PCR法初筛活性化合物的结果
        4.4.4 活性化合物Orobol的q-PCR实验验证
        4.4.5 细胞毒性实验
        4.4.6 体内实验
    4.5 本章小结
5 先导化合物结合模式的研究及修饰
    5.1 引言
    5.2 蛋白-配体复合物的MD模拟
    5.3 基于反应的原位生长方法优化先导化合物
    5.4 结果分析
        5.4.1 MD模拟结果分析
        5.4.2 分子对接结果分析
        5.4.3 基于反应的原位生长方法优化先导化合物结果分析
    5.5 本章小结
结论
创新点与展望
参考文献
攻读硕士学位期间发表学术论文情况
致谢



本文编号：3935982