利用酵母双杂交技术筛选鉴定与番茄环纹斑点病毒NSs蛋白互作的西花蓟马蛋白

发布时间：2024-05-11 12:00

　　【目的】筛选鉴定西花蓟马Franiklinella ocicdentalis体内与番茄环纹斑点病毒(tomato zonate spot virus, TZSV)NSs蛋白互作的介体因子。【方法】利用酵母双杂交技术筛选与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白;进行序列分析鉴定后,将捕获的蛋白与NSs基因回转到酵母细胞,利用营养缺陷型培养基鉴定蛋白互作情况。再利用GST Pull-down技术验证TZSV NSs与鉴定出的西花蓟马蛋白的体外互作关系。【结果】构建了TZSV NSs的酵母双杂交诱饵质粒pGBKT7-NSs,确定了诱饵质粒对酵母AH109细胞无毒性,并且无自激活活性。序列分析发现与TZSV NSs互作的西花蓟马蛋白为类电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion-selective channel-like, VDAC)。酵母回转实验显示TZSV NSs与西花蓟马VDAC在酵母细胞内存在特异性互作。GST Pull-down结果表明TZSV NSs与西花蓟马VDAC在体外存在相互作用。【结论】通过酵母双杂交和GST Pull-down技术,分别在酵母细胞内...

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【部分图文】：

图1PCR扩增TZSVNSs

以TZSV侵染植株总RNA反转录后的cDNA为模板,PCR扩增TZSVNSs。如图1所示,获得1380bp的特异性片段,与预期TZSVNSs片段大小一致。扩增产物构建至pEASY-T1克隆载体,获得pEASY-NSs,经NdeⅠ/BamHⅠ双酶切验证,得到3928bp....

图2pEASY-NSs克隆质粒(A)和pGBKT7-NSs重组质粒(B)的双酶切鉴定

比较转化有诱饵载体pGBKT7-NSs及空载体pGBKT7的酵母AH109细胞,发现两组菌落均为白色或棕色,且大小、数量均匀一致(图3),表明NSs蛋白表达对酵母AH109细胞无毒性。比较分别转化有pGBKT7-NSs/pGADT7-T,阳性载体pGBKT7-p53/pGADT7....

图3pGBKT7-NSs诱饵质粒对AH109酵母细胞的毒性

图2pEASY-NSs克隆质粒(A)和pGBKT7-NSs重组质粒(B)的双酶切鉴定2.3酵母双杂交筛选与TZSVNSs互作的西花蓟马蛋白

图4pGBKT7-NSs诱饵质粒对AH109酵母细胞的自激活

将西花蓟马cDNA文库质粒转化到含有诱饵质粒pGBKT7-NSs的AH109感受态细胞,观察菌落生长及变蓝情况(图5)。挑取菌落生长状况变蓝的菌落,接种至加有氨苄青霉素的SD/-Trp/-Leu液体培养基中扩繁并提取酵母质粒,PCR鉴定cDNA插入片段的大小。将扩增大于500b....

本文编号：3969920