柽柳ThSOS3基因的耐盐功能分析

发布时间：2020-04-18 00:21

【摘要】：SOS(Salt Overly Sensitive)信号转导途径是目前研究最清楚的耐盐途径之一,SOS途径的重要生理功能就是植物在盐胁迫下进行离子稳态调节和提高耐钠性。SOS家族基因主要有SOS1、SOS2、SOS3、SOS4、SOS5,其中SOS1、SOS2、SOS3三个基因参与介导了细胞内离子平衡的SOS信号转导途径。在高盐信号刺激下使细胞内的Ca2+水平发生变化,Ca2+作为第二信使与SOS3结合启动SOS信号途径将盐信号传递下去。本研究通过对刚毛柽柳转录组序列查找分析,筛选出4个SOS信号途径全长基因(命名为ThSOS1、ThSOS2、ThSOS3-1、ThSOS3-2),对该信号基因进行了ExPASy-PROSITE分析、多序列比对和进化树分析,利用实时荧光定量RT-PCR分析了不同胁迫处理下刚毛柽柳中4个ThSOS基因的表达,进一步通过稳定转化拟南芥和瞬时转化柽柳分析了ThSOS3-1和ThSOS3-2基因的抗逆功能。具体研究结果如下:对4个ThSOS基因的生物信息学分析结果显示ThSOS1为Na+/H+反转运蛋白,编码1165个氨基酸,分子量为128 KD,C端是一段位于细胞质内的具有亲水性的尾巴,N端是由10-12个跨膜脂性区域组成的疏水区;ThSOS2为一个Ser/Thr类蛋白激酶,编码456个氨基酸,分子量为51.4KD,N端有一个长为26个氨基酸编码的催化区域,C末端有一个长为21个氨基酸编码的调节区域(FISL结构),这段序列同与其自身的N端催化区域结合引起SOS2激酶活性的自我抑制;ThSOS3蛋白编码一个Ca2+结合蛋白,含有3个EF-臂的构型,和Ca2+具有较高的亲和性,N-末端含有一个十四酰化(豆蔻酰化)的位点,其中ThSOS3-1基因具有一个典型FRQ1 Multi-domain结构域,ThSOS3-2基因具有Ca2+离子结合位点、EFh超级家族,FRQ1 Multi-domain结构域。多序列比对结果显示4个ThSOSs基因之间序列一致性不高,但两个ThSOS3基因(ThSOS3-1与ThSOS3-2)的氨基酸序列一致性为65%,与拟南芥AtSOS3基因归为一组。为了分析4个ThSOSs基因是否参与柽柳逆境胁迫应答,利用实时定量RT-PCR分析了0.4MNaCl,20%(w/v)PEG6000和100μMABA胁迫处理后4个ThSOSs基因的表达情况,结果显示,这4个基因都能对这些胁迫做出响应,但胁迫不同时间和柽柳的不同组织中的表达模式各不相同。这些基因在根中均上调表达,在叶中下调表达;NaCl和甘露醇胁迫处理后在根中的表达也较为相似,且发现4个ThSOSs基因对盐信号及A]BA信号较为敏感。由于SOS3基因是SOS信号途径的起始信号基因,而各基因在根中表达量的最大值相差不大,因此,进一步对两个ThSOS3基因的抗逆功能进行了分析。构建了植物过表达载体pROKII-ThSOS3-1/hSOS3-2,将植物过表达载体pROKII-ThSOS3-1/ThSOS3-2稳定转化拟南芥,分析比较胁迫处理(NaCl、甘露醇)后转ThSOS3-1/ThSOS3-2基因和野生型拟南芥形态和生理指标差异,以综合评定ThSOS3-1和ThSOS3-2基因的抗逆功能。结果显示,盐和甘露醇胁迫后,转ThSOS3-1和ThSOS3-2基因拟南芥的种子萌发率和鲜重都明显高于对照。盐和甘露醇胁迫后,过表达植株的长势也强于野生型。进一步分析比较了转基因植株与对照植株的生理染色和生理指标情况。NBT、DAB和伊文思蓝化学染色分析结果表明,胁迫后转基因pROKII-ThSOS3-1/ThSOS3-2植株的叶片着色比对照着色浅。转pROKII-ThSOS3-1/ThSOS3-2基因植株中叶绿素含量和SOD、POD保护酶的活性明显比野生型植株高,MDA含量和相对电导率值明显比对照低。这些结果表明过表达ThSOS3-1/ThSOS3-2基因拟南芥在盐和干旱胁迫后,能维持更高的保护酶活性,较低的细胞活性氧的含量,细胞损伤程度更轻。从而具有更高的抗旱耐盐能力。为了验证异源拟南芥表达的结果,进一步构建了抑制表达载体pFGC5941-Th7SOS3-1/ThSOS3-2,将过表达(pROKⅡ-ThSOS3-1/ThSOS3-2)、抑制表达(pFGC5941-ThSOS3-1/ThSOS3-2)及对照载体(pROKII)瞬时侵染柽柳,在柽柳中分析2个ThSOS3基因的耐盐功能。NBT、DAB生理染色和SOD、POD生理指标测定的结果显示,150mMNaCl胁迫处理后,过表达ThSOS3转基因柽柳植株着色要比对照植株着色浅,抑制表达ThSOS3转基因柽柳植株的叶片着色要比对照植株叶片着色深;过表达ThSOS3转基因柽柳植株中SOD、POD保护酶的活性最强,而抑制表达ThSOS3转基因柽柳植株中SOD、POD保护酶的活性最低,伊文思蓝染色和MDA含量测定结果表明,盐胁迫后,与对照相比,过表达ThSOS3转基因柽柳植株着色浅且MDA含量低,抑制表达ThSOS3转基因柽柳植株着色深且MDA含量高。表明SOS3基因可通过调节保护酶类的活性,增强细胞内清除活性氧能力,使细胞内的O2-·和H202这类活性氧物质的积累减少,增强植物的耐盐性,是一个优良的耐盐基因。
【图文】：

分析结果图,十四酰,位点,柽柳

邋ＳＪＴ＾Ｃ邋：？逡逑图２－２邋７ＭａＳ２蛋白的Ｐｆａｍ分析结果逡逑柽柳７ＡＳＯＳｙ－／基因具有一个典型ＦＲＱ１邋Ｍｕｌｔｉ－ｄｏｍａｉｎ结构域（图２－３邋），柽柳逡逑７ＭＯＳ：Ｊ－２基因具有Ｃａ２＋离子结合位点、ＥＦｈ超级家族，ＦＲＱ１邋Ｍｕｌｔｉ－ｄｏｍａｉｎ结构域（图２－逡逑４）。以往研究表明，ＳＯＳ３基因编码一个Ｃａ２＋结合蛋白，含有３个ＥＦ－臂的构型，和Ｃａ２＋逡逑具有较高的亲和性。Ｓ０Ｓ３的Ｎ－末端含有一个十四酰化（豆蔻酰化）的位点，为了研究逡逑这个豆蔻酰化位点，对Ｓ０Ｓ３ｍＲＮＡ进行体外用放射元素标记豆蔻酸和豆蔻转移酶处逡逑理，观察结果表明Ｓ０Ｓ３的Ｎ－端甘氨酸（Ｇｌｙ２）被十四酰化。十四酰化对Ｓ０Ｓ３的活性及逡逑功能的激发都至关重要，若将Ｇｌｙ２突变为Ａｌａ导致十四酰化失败，使ＳＯＳ３蛋白互补ｓ0ｓ３逡逑突变植株失去了盐敏感表型能力。因此，Ｓ０Ｓ３Ｎ端的Ｇｌｙ２豆蔻酰化的位点是Ｓ０Ｓ３调节结逡逑合于质膜上的离子载体的活性及提高植物盐敏感表型能力的重要位点。逡逑０邋Ｓｈｏｗ邋Ｃｏｎｓｅｒ＾ｅｆｌ邋Ｄｏｍａｉｎｓ逡逑Ｐｕｔａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ

分析结果图,十四酰,位点,柽柳

逦逦逡逑Ｐｕｔａｔｉｖｅ邋ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ邋ｄｏｍａｉｎｓ邋ｈａｖｅ邋ｂｅｅｎ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ，邋ｃｌｉｃｋ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｉｍａｇｅ邋ｂｅｌｏｖ／邋ｆｏｒ邋ｄｅｔａｉｌｅｄ邋ｒｅｓｉｓｔｓ．逡逑ｉ逦？？逦？＊逦＞＊＊＊逦ｉｒｓ？逡逑ｆ＾ｉｃ邋ｂｉａ４＞？？邋＜＞４？逡逑Ｓｐｅｃｉｆｉｃ邋ｈｉｔｓ逦ｃｉＰＫｊｅ逡逑ｓｕｐ？邋ｆａ？？ｍ？２逦ｌ＾ｃ．ｌ邋ｉｋ？邋ｓｕｐｅｒｆａｎｉｌｙ逦ｊ逡逑Ｈｕｌｔｉ－ｄｏｎａｉｎｓ逦－逦，邋ＳＪＴ＾Ｃ邋：？逡逑图２－２邋７ＭａＳ２蛋白的Ｐｆａｍ分析结果逡逑柽柳７ＡＳＯＳｙ－／基因具有一个典型ＦＲＱ１邋Ｍｕｌｔｉ－ｄｏｍａｉｎ结构域（图２－３邋），柽柳逡逑７ＭＯＳ：Ｊ－２基因具有Ｃａ２＋离子结合位点、ＥＦｈ超级家族，ＦＲＱ１邋Ｍｕｌｔｉ－ｄｏｍａｉｎ结构域（图２－逡逑４）。以往研究表明，，ＳＯＳ３基因编码一个Ｃａ２＋结合蛋白，含有３个ＥＦ－臂的构型，和Ｃａ２＋逡逑具有较高的亲和性。Ｓ０Ｓ３的Ｎ－末端含有一个十四酰化（豆蔻酰化）的位点，为了研究逡逑这个豆蔻酰化位点，对Ｓ０Ｓ３ｍＲＮＡ进行体外用放射元素标记豆蔻酸和豆蔻转移酶处逡逑理，观察结果表明Ｓ０Ｓ３的Ｎ－端甘氨酸（Ｇｌｙ２）被十四酰化。十四酰化对Ｓ０Ｓ３的活性及逡逑功能的激发都至关重要，若将Ｇｌｙ２突变为Ａｌａ导致十四酰化失败，使ＳＯＳ３蛋白互补ｓ0ｓ３逡逑突变植株失去了盐敏感表型能力。因此，Ｓ０Ｓ３Ｎ端的Ｇｌｙ２豆蔻酰化的位点是Ｓ０Ｓ３调节结逡逑合于质膜上的离子载体的活性及提高植物盐敏感表型能力的重要位点。逡逑
【学位授予单位】：东北林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S793.5

【参考文献】