山白树的微卫星分子标记开发与遗传多样性分析

发布时间：2020-06-18 15:41

【摘要】：山白树(Sinowilsonia henryi Hemsl)为金缕梅科(Hamamelidaceae)山白树属(Sinowilsonia Hemsl)多年生木本植物,是中国特有单种属珍稀濒危植物。由于人为砍伐及生境变化等原因,导致山白树数量急剧减少,已被列为我国Ⅱ级保护植物及陕西省重点保护植物,被世界自然保护联盟(IUCN)认定为易危物种。作为第三纪孑遗种和中国特有物种,山白树具有重要的经济价值和科学研究价值。本研究基于第二代测序技术开发了山白树的微卫星分子标记,并利用该分子标记对山白树进行群体遗传分析,以期对其物种保护提供理论参考。采用Illumina二代测序技术建立山白树基因组文库和微卫星文库,分析微卫星组成类型等特征,设计山白树微卫星引物,用5个山白树种群进行扩增和检测以分析其多态性。研究结果表明,二代测序共返回38,942,660条100bp配对序列,通过质量修剪及拼接得到200,386条拼接序列,其中长度大于335bp的为7614条;在7614条序列中检测出微卫星位点694个,其中单核苷酸重复最多,单核苷酸重复中A/T重复数量最多;二核苷酸长度变异最大,其中AG/CT重复数量最多,重复长度变异情况与微卫星丰度呈正相关。为36条山白树微卫星重复次数高的序列设计引物,通过PCR扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳对所设计的引物进行检测,结果表明,其中20对引物多态性丰富且条带清晰,等位基因数(N_A)在3~6之间,平均为4,多态性信息含量(PIC)为0.5355~0.7540,平均为0.6155。对5个山白树种群的群体遗传分析发现,本研究开发的引物可用性较好。本研究开发了山白树微卫星分子标记引物,为山白树分子遗传学奠定了基础。本研究利用筛选的20对山白树微卫星引物,对采自山白树主要分布区的19个居群201份样品进行检测,统计实验数据,分析其遗传多样性与遗传分化。本研究通过计算山白树遗传参数和居群间Nei’s遗传距离分析各山白树居群的遗传关系,并分析及计算山白树居群间遗传分化指数和遗传结构。结果表明:(1)20对山白树引物均具有较高的多态性,各位点的等位基因数在7~18之间,共检测到变异位点239个,平均每对引物11.95个变异位点,期望杂合度(H_E)为0.6790~0.8604,平均期望杂合度为0.7993。Shannon’s信息指数(I)为1.4279~2.2222,平均值为1.8937。Nei’s遗传多样性指数(h)为0.6773~0.8583,平均为0.7973,表明山白树在物种水平上的遗传多样性较高。(2)通过AMOVA分析结果显示,山白树的遗传变异主要来源于居群内,居群间遗传分化强烈(F_(st)=0.3439),居群间基因流较弱(N_m=0.4769)。(3)UPGMA聚类结果表明,遗传距离相近的居群,地理位置分布也相对较近。Mantel Test结果显示,R=0.288,P=0.01,即山白树遗传距离与地理距离存在显著相关性。STRUCTURE分析结果将19个山白树居群分成4个组。可知,导致山白树居群遗传分化显著的原因可能有地理隔离、有限的基因流、居群历史上遭遇片段化及瓶颈效应等。基于本研究结果,我们提出了就地保护为主的保护策略。
【学位授予单位】：陕西理工大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.99
【图文】：

山白树,长度变异,微卫星,重复单元

图 2-1 山白树基因组序列中含不同长度重复单元的微卫星长度变异情况注：饼图每一扇区对应不同长度的微卫星，若对应长度微卫星频率≤1%，则一起合并在黑色扇区内。Fig. 2-1 Length diversification of the microsatellites in genome sequences of S. henryi.Note: each section of the pie chart corresponds to a microsatellite of different lengths, if thecorresponding length of microsatellite frequencies≤1%, together with the black sector areas.2.4.3 山白树 SSR 引物的筛选本研究初筛选采用 24 个来自佛坪种群的山白树样本对 36 对引物（表 2-5）进行扩增和检测，结果表明，有 7 对引物未能在扩增出目标条带，有 9 对引物仅扩增出 1 条条带（没有多态性），其余 20 对引物能扩增出清晰稳定的条带且具有多态性（图 2-2），可以用与后续研究。用初筛选过所得条带清晰且具有多态性引物对 SNJ、JSX、WDS、HLS种群进行 PCR 扩增和聚丙烯酰胺凝胶电泳检测。利用 Powermarker 软件统计了这 20 对引物的等位基因数目等多态性信息（表 2-6），这 20 个多态性位点的等位基因数（NA）共 74 个，变化范围为 3～6，平均值为 4；多态性信息含量（PIC）范围为 0.5355～0.7540

佛坪,引物,种群

SBSSSR013 257-263 3 0.5103 0.3636 0.5769SBSSSR014 256-266 4 0.4576 0.3182 0.6915SBSSSR018 87-91 3 0.4298 0.3636 0.5355SBSSSR019 119-125 4 0.4535 0.3182 0.7540SBSSSR021 147-159 4 0.4246 0.3636 0.7338SBSSSR022 303-311 4 0.4246 0.3182 0.6174SBSSSR025 101-107 3 0.4246 0.3636 0.5697SBSSSR028 130-136 4 0.5124 0.3268 0.6713SBSSSR029 211-220 4 0.586 0.4444 0.6218SBSSSR030 245-251 4 0.625 0.4444 0.6874SBSSSR031 195-199 3 0.5632 0.5 0.5499SBSSSR032 215-211 6 0.6466 0.7222 0.6391SBSSSR035 81-85 3 0.6234 0.5555 0.5387SBSSSR036 141-145 6 0.5787 0.6666 0.5547平均 4 0.4903 0.4012 0.615510bpM 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24

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