毛白杨PtDFR基因克隆分析及MYB183基因编辑初探

发布时间：2020-06-19 10:17

【摘要】：毛白杨(Populus tomentosa)是我国特有的白杨派乡土树种,主要分布于黄河流域、淮河流域的10个省份,在林业生产、生态保护和城乡绿化占有重要地位。实践中杨树彩叶品种较少,不能满足生态文明建设中“延绿增彩”的需求及市场对品种多样化的趋势。因此,开展毛白杨花青素合成途径关键基因的克隆及其特性研究,并对其进行功能鉴定,对于阐明杨树叶色变异的分子机制具有重要的理论意义,同时可为基因工程改良创制新的杨树彩叶新品种提供有价值的候选基因。本研究基于转录组数据通过PCR方法克隆获得毛白杨PtDFR基因,采用生物信息软件进行了一系列特性分析,通过转录组分析揭示该基因的表达模式。采用基因编辑技术--CRISPR/Cas9对杨树MYB183进行了初步研究。为后续对毛白杨的遗传改良及进一步解析毛白杨花青素合成途径相关基因的功能奠定了基础。主要研究结果如下(1)根据毛白杨转录组数据设计DFR基因PCR引物,通过PCR扩增获得了毛白杨DFR基因家族的1个成员,命名为PtDFR。测序结果表明,该基因序列全长为1,59lbp,包含6个外显子和5个内含子,CDS长度为954bp,编码317个氨基酸,具有1个NADP(H)保守结构域和1个底物特异性结合位点。理化性质和功能域分析表明,基因编码的蛋白质分子量为38.06 kD,理论等电点为5.62,翻译后的蛋白质不是分泌蛋白且为亲水性蛋白,具有两个跨膜结构域。氨基酸序列相似性分析,毛白杨与银白杨、毛果杨DFR氨基酸相似性高达95.65%和94.21%,而与柑橘、枣、葡萄等7个物种DFR氨基酸相似性达到89.29%～82.14%。进化分析表明,毛白杨与毛果杨、银白杨遗传距离最近聚为一组,与单子叶植物小麦、水稻距离较远。转录组数据分析显示,PtDFR在不同组织器官中的表达量存在明显差异,在萌动营养芽表达量最高,休眠营养芽最低,在不同时期雌雄花芽表达趋势相似。(2)利用CRISPR/Cas9技术,依据毛果杨MYB183设计构建了 6个单sgRN A靶点载体,并采用农杆菌介导法在毛白杨中进行了转化。通过PCR筛选得到部分阳性株系,经测序分析对比野生型与阳性转基因植株发现,6号靶点阳性转基因植株发生了碱基的改变,进一步进行氨基酸比对分析,发现转基因株系S9、S37与野生型株系氨基酸序列没有发生变化,其原因可能同义突变或由于等位基因间序列存在差异导致编码氨基酸没有发生变化。
【学位授予单位】：北京林业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S792.117
【图文】：

毛白杨,无规则,螺旋,转角

Ａ：邋ＤＦＲ邋ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ；邋Ｂ：邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃｉｔｙ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｉｔｙ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋ＤＦＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ邋ｏｆ邋Ｐ．邋ｔｏｍｅｎｔｏｓａ＼逡逑Ｃ：邋Ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＰｔＤＦＲ邋ｐｒｏｔｅｉｎ逡逑图３－５毛白杨ＤＦＲ的信号肽、亲水性／疏水性和跨膜结构域逡逑Ｆｉｇ．３－５邋Ｓｉｇｎａｌ邋ｐｅｐｔｉｄｅ，邋ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ／ｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃ邋ａｎｄ邋ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ邋ｄｏｍａｉｎ邋ｏｆ邋ＤＦＲ邋ｏｆ逡逑Ｐ．ｔｏｍｅｎｔｏｓａ逡逑３．２．５毛白杨编码蛋白的二级结构逡逑利用ＳＯＰＭＡ在线分析软件对ＤＦＲ蛋白进行二级结构预测，结果（如图３－６）逡逑显示

靶点,转基因,野生型,碱基

逡逑图５－２转基因苗ＰＣＲ检测图逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋５－２邋ＰＣＲ邋ｉｎｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ邋ｐｌａｎｔｌｅｔｓ逡逑将上述筛选出的阳性转基因株系利用靶点两端侧翼序列特异引物进行ＰＣＲ逡逑反应，获得的产物进行切胶回收后送至公司进行测序，进一步的分析确定靶目标逡逑位点序列是否发生变化。将野生型与阳性转基因苗测序结果比对之后发现，靶点逡逑为ｓｇＲＮＡ６（图５－２）的阳性转基因苗发生了序列的变化，其中Ｓ９号株系（图５－３）逡逑发生了多碱基的转换，原本为ＴＴ碱基变为ＣＡ碱基，ＣＡＧ碱基变为ＧＣＴ碱基，Ｔ逡逑碱基变为Ａ碱基；Ｓ３７号株系由ＴＴ碱基变为ＣＡ碱基，ＧＴ碱基变为ＡＡ碱基。逡逑利用ＤＮＡＭＡＮ软件进行氨基酸比对，发现转基因株系Ｓ９、Ｓ３７与野生型株系氨逡逑基酸序列没有发生变化，这可能是由于氨基酸有多个对应的密码子，属于同义密逡逑码子

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