巴西橡胶树白粉病广谱抗性基因HbMlo的功能研究和应用

发布时间：2020-06-24 14:37

【摘要】：巴西橡胶树的生长发育受多种生物和非生物胁迫的影响,其中白粉病是橡胶树一种重要的叶部病害,会导致橡胶树叶片大面积掉落,对橡胶树的生长和产量造成巨大的经济损失。Mlo基因是植物特有的一类基因,其编码的蛋白能够参与多种细胞过程,其隐性等位基因mlo对白粉病具有持久的抗性,但橡胶树中有关Mlo基因及其功能鲜有报道。为探究橡胶树Mlo基因的结构和功能,本研究通过生物信息学分析,在橡胶树叶片转录组数据库中进行全面的搜索和鉴定;采用分子生物学技术,克隆、鉴定并分析HbMlos的结构与功能,并用于抗病品种的筛选;对克隆得到的HbMlos基因在白粉菌侵染、逆境胁迫和植物激素等诱导下的基因表达模式进行分析;采用瞬时表达技术确定橡胶树HbMlo12蛋白的亚细胞定位;采用遗传转化,获得过表达HbMlo12基因的拟南芥植株,分析转基因植株生长发育的表型以及对干旱胁迫、白粉菌侵染的响应情况。结果如下:1.从橡胶树中新克隆了 2个Mlo基因,可能参与橡胶树的胁迫响应过程。HbMlol-1和HbMlo7是由510和499个氨基酸组成的稳定性疏水蛋白,定位在内质网膜上。二者均存在一个Mlo家族保守结构域,7个跨膜螺旋结构。HbMlo1-1和HbMlo7基因在茎、叶片、花、胶乳和树皮中均有表达。在白粉菌侵染后,HbMlo1-1上调表达,HbMlo7下调表达,其表达还受到机械伤害、干旱胁迫以及H2O2、ABA、ETH和MeJA的诱导,但两基因在结构上不具有与白粉病相关的保守结构域。2.对已克隆的橡胶树HbMlos和其他物种中已知功能的Mlo进行结构和表达分析发现,HbMlo12含有与白粉病抗性相关的两段保守结构域和钙调素结合蛋白区域。HbMlo12与双子叶植物中已知具有广谱抗性的Mlo (SIMlo1、AtMlo2、AtMlo6、AtMlo12等)聚在第V分支上,在白粉病的诱导下上调表达,因此推测HbMlo12最可能是橡胶树中与白粉病抗性相关的Mlo基因。3.同一HbMlo在橡胶树不同抗、感品种中表达水平各异,不同HbMlos在同一品种中的表达量也不同,其表达与抗、感表型之间没有明显的相关性。4.HbMlo12定位于细胞质中,获得了转HbMlo12基因拟南芥纯合植株。通过比较不同株系拟南芥生长状况,发现HbMlo12/Col-0和HbMlo12/Atmlo2-9转基因拟南芥植株生长状况劣于野生型Col-O植株,HbMlo12对转基因拟南芥植株的生长发育具有一定的影响。在干旱胁迫下,转基因拟南芥的抽薹时间较野生型晚,HbMlo12在一定程度上增强了转基因拟南芥在幼苗期的耐旱能力。在橡胶树白粉菌侵染下,通过观察接种部位的变化,初步推断四种拟南芥株系的感病能力为:Col-0HbMlo2/Col-0HbMlo2/Atmlo2-9Atmlo2-9,由此可以推测,HbMlo12在转基因拟南芥与橡胶树白粉菌的亲和性互作中具有一定的作用。5.通过HbMlo12鉴定发现,与白粉病抗性相关的SNP位点可能有47个,其中有41个是单碱基突变,在2762、2917和2922三个位点出现多碱基突变,2007和2781位点则出现多碱基的插入,960位点出现多碱基的丢失。根据以上结果,得出以下结论:1.HbMlo1-1和HbMlo7属于Mlo家族成员,与干旱和机械伤害胁迫以及植物激素刺激有关。2.预测橡胶树Mlo家族在橡胶树的生长、植物激素刺激以及非生物胁迫中均具有一定的功能,其中HbMlo12是橡胶树中与白粉病抗性相关的Mlo基因。3.通过转基因拟南芥研究发现,HbMlo12参与转基因拟南芥的生长发育和干旱胁迫响应过程。白粉菌侵染四种拟南芥株系,结果初步证明了HbMlo12在转拟南芥植株中具有感橡胶树白粉病的能力,表明HbMlo12是橡胶树中白粉病广谱抗性相关的候选基因。4.通过不同抗、感种质中HbMlo12的序列分析,发现47个多态性位点,可用于开发SNP标记筛选白粉病抗性种质。本研究阐明了HbMlos基因家族在橡胶树白粉病和逆境胁迫中的功能,为研究橡胶树抗白粉病机制提供理论基础,为筛选和培育橡胶树抗白粉病种质提供依据。
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S763.7
【图文】：

原理图,反应体,特异性引物,融合表达载体

２．５邋ＨｂＭｌｏｌ２亚细胞定位检测逡逑２．５．１融合表达载体构建逡逑融合表达载体构建原理如图５。逡逑Ｒ）逦ｆ逦＼＾ｆｌｏｎ逡逑Ｓ＾Ｊ逦Ｉ邋—１：邋＼ｚ逡逑Ｔ邋ＭＷｔｈｐ邋Ｊ＇ｍ（，，Ｐ逦ｊＬ邋ＪＯＯＯｂｐ邋Ｔ逡逑ｖｌｙ，ｃｒ邋－Ｖ二ｙ逡逑l我镥雧韬湾义希拢睿恚蓉瓩丨刀位点．ＰＣＲ逡逑贪敌？切位点的丨丨ｂｌＶ丨ｌｏ丨２片段逡逑找体片段逡逑逦以鹄叻丨叫收１「Ｉ的片段逡逑Ｔ４迮拔的迮按逡逑Ｎｏｓ邋ｐｒｏ邋（，逡逑ｐｒ“逡逑Ｘｈｏｌ逡逑Ｂａｓｔａ产逦ｓＸ逡逑Ｍ逦Ｙ＼ＨｂＭＩ？．ｌ２逡逑Ｎｏｓ邋ｉｃｒＭ．邋３５Ｓ：邋Ｉ０Ａ１１？，１２：邋Ｉ；！邋Ｐ逦Ｕ－邋ＲａｍＨｌ逡逑ｙ逦ＩｍＧＦＰ逡逑Ｉ逦６９Ｏ０ｂｐ逦Ｔ＂逡逑ｖｌｙ；＾逡逑图５基因过表达载体构建原理图逡逑Ｆｉｇ．邋５邋Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ邋ｄｉａｇｒａｍ邋ｏｆ邋ｇｅｎｅ邋ｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ邋ｖｅｃｔｏｒ邋ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ逡逑（１）根据设计的特异性引物（见表３）对进行ＰＣＲ扩增，反应体逡逑系和程序如表８图６：逡逑表８／／６Ｍ０／２邋ＰＣＲ扩增体系逡逑Ｔａｂｌｅ邋８邋ＰＣＲ邋ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ邋ｓｙｓｔｅｍ邋ｏｆ邋ＨｂＭｌｏｌ２逡逑质粒邋ＨｂＭｌｏｌ２逦１邋

机械伤害,橡胶树,基因

机械伤害作用下，基因在处理０．５ｈ，表达水平显著上调，是处理逡逑前的１．４倍。随着机械伤害处理时间的延长，基因的表达水平呈现显著下降的趋逡逑势（图１５）。说明基因在橡胶树机械伤害的早期被诱导表达。逡逑１．６邋－邋．逡逑Ａ逡逑ｆ邋１－４－邋N逡逑１邋１２邋“邋｜逡逑ｇ邋１．０逡逑０．８逡逑１ｌｌｉｉｉｉ逡逑０邋０．５邋１邋２邋６邋１２逡逑时间／Ｖｉ逡逑图１５机械伤害处理下／／６Ｍ／０７－／基因的表达分析逡逑Ｆｉｇ．邋１５邋ＨｂＭｌｏｌ－１邋ｅｘｐｒｅｓｉｏｎ邋ａｎａｌｙｓｉｓ邋ｕｎｄｅｒ邋ｍｅｃｈａｎｉｘａｌ邋ｗｏｕｎｄｉｎｇ邋ｔｒｅａｔｍｅｎｔ逡逑３１逡逑

【参考文献】