橡胶树白粉菌响应基因HbAPC10的分子调控机制研究

发布时间：2020-10-20 20:34

　　 泛素-蛋白酶体系统(UPS)通过对底物蛋白的泛素化修饰和降解调节绝大多数代谢过程。APC/C复合体是一类重要的泛素连接酶,与细胞分裂直接相关,而APC10是APC/C复合体的核心亚基,参与细胞衰老、细胞分化等过程。尽管UPS的重要功能在模式植物中已经得到广泛的证明,但在橡胶树中有关UPS的研究鲜有报道。本研究在筛选和鉴定橡胶树白粉菌响应相关基因中,发现HbAPC10基因受白粉菌诱导显著上调表达。为了全面解析HbAPC10基因在橡胶树中的功能,本研究以橡胶树热研7-33-97胶乳为材料,提取总RNA,并反转录成cDNA,克隆出HbAPC10基因,并采用Q-PCR技术系统地分析HbAPC10在橡胶树白粉菌侵染、外源激素处理和胁迫下的表达模式;分析其结构并通过亚细胞定位和apc10ts突变体互补实验证明HbAPC10是APC/C的亚基,具有保守功能;并构建高质量胶乳均一化酵母双杂交cDNA文库,将HbAPC10构建到酵母表达载体pGBKT7并转化酵母菌株Y2H Gold成诱饵菌株HbAPC10-bait-Y2H Gold,用该诱饵菌株与酵母双杂交cDNA文库杂交筛选与HbAPC10互作的蛋白,并通过酵母双杂交验证HbAPC10与互作蛋白的互作关系,并进一步分析互作蛋白基因在橡胶树白粉菌侵染、外源激素处理和胁迫下的表达模式,结果如下:1. HbAPC10响应橡胶树白粉菌、外源激素和胁迫处理,可能在橡胶树抗病、抗逆中起作用。表达模式分析发现,在橡胶树各组织中均有表达,并且在叶片中高表达,表明其功能主要和叶片相关;HbAPC10在橡胶树白粉菌处理时,0-3 h下调表达,6-72 h上调表达,72 h表达量最高;在外源激素(茉莉酸甲酯,MeJA: jasmonates;脱落酸,ABA: abscisic acid;乙烯利,ETH: ethylene,)处理时均上调表达,6-10 h表达量最高;在伤害处理时均上调表达6-10 h表达量最高;在泛素化抑制剂MG132处理时上调表达,在72 h表达量最高;说明HbAPC10可能在橡胶树抗病、抗逆中起作用。2.HbAPC10的开放性阅读框(ORF)为579bp,编码192个氨基酸,生物信息学分析发现其具有一个保守的APC10保守结构域。3.采用烟草瞬间表达技术分析HbAPC10的亚细胞定位,通过激光共聚焦显微镜观察发现融合蛋白35S:XXGFP-HbAPC10定位于细胞核中。4. HbAPC10能够恢复温度敏感型裂殖酵母突变体apc10ts的功能,使其能够在严格温度(35℃)条件下正常生长,表明HbAPC10是一个具有功能的APC10蛋白,不同物种的APC10具有保守的功能。5.酵母双杂交文库筛选获得两个与HbAPC10互作的蛋白HbSRPP和HbPRS4。HbSRPP是天然橡胶生物合成关键酶,HbPRS4编码磷酸核糖焦磷酸激酶。进一步采用点对点的酵母双杂交技术验证HbAPC10与HbSRPP、HbPRS4的互作关系,表明HbAPC10可能通过与天然橡胶生物合成关键酶HbSRPP互作,参与调控天然橡胶合成和防御反应。6.系统进化关系分析发现HbPRS4属于Ⅱ型的PRS,与菠菜SoPRS4和拟南芥AtPRS4高度同源。表达模式分析发现,HbPRS4在橡胶树各组织中均有表达,并且树皮中特异性表达,表明其功能主要和树皮相关;橡胶树白粉菌处理时,HbPRS4在0-3 h上调表达,6-24 h表达量维持不变,48 h表达量最高,48-72h下调表达至4倍表达水平;外源ABA和伤害处理时,HbPRS4下调表达;ETH和MeJA处理后HbPRS4上调表达;MG132诱导HbPRS4上调表达MG132,说明HbPRS4参与响应橡胶树白粉菌侵染、多种外源胁迫和防御反应。本研究阐明HbAPC10参与橡胶树抗病和抗逆反应、细胞分裂和天然橡胶合成等多个过程,为研发橡胶树产量调控技术和抗病育种提供理论基础和实践指导。
【学位单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2017
【中图分类】：S763
【部分图文】：

在拟南芥中发现两种Ｅｌｓ，至少３７种Ｅ２ｓ和１４００种Ｅ３ｓ（Ｖｉｅｒｓｔｒａ，２００９）。??Ｅ３ｓ由多个基因家族编码合成，根据泛素从Ｅ２转移到底物过程的机制差异，将??其分为ＨＥＣＴ－Ｅ３Ｓ和（ＲＩＮＧ）?／Ｕ－ｂｏｘＥ３ｓ两种，如图１所示。Ｅ３ｓ在泛素化过??程中可以是单个或是多个亚基共同作用（Ｐｉｃｋａｒｔ，２００１）。在拟南芥基因组中，??ＨＥＣＴ－Ｅ３Ｓ是最小的结构域，（ＲＩＮＧ）?／Ｕ－ｂｏｘ?Ｅ３ｓ是与Ｅ２互作最多的结构域??（Ｓｍａｌｌｅ?ａｎｄ?Ｖｉｅｒｓｔｒａ，２００４；?Ｓｔｏｎｅ?ｅｔａｌ．，２００５）。ＨＥＣＴ－Ｅ３Ｓ?包含泛素结合区域??和Ｅ２结合区域，（ＲＩＮＧ）／Ｕ－ｂｏｘ?Ｅ３ｓ包含ＳＣＦ复合体、ＥＣＳ复合体、ＣＵＬ３－ＢＴＢ??复合体、ＣＵＬ４－ＤＤＢ和ＡＰＣ复合体，不同复合体由它们的多亚基共同作用特??异性识别和结合底物，其中ＳＣＦ复合酶体是（ＲＩＮＧ）?／Ｕ－ｂｏｘ?Ｅ３ｓ中最多的复??合酶体（Ｐｅｔｒｏｓｋｉ?ａｎｄ?Ｄｅｓｈａｉｅｓ，２００５）。??２??

替代内质网相关泛素化以及胞质泛素连接酶，泛素蛋白酶体系统（ＵＰＳ?）??导向新的耙标，防止进一步扩大感染（Ｖｅｒｃｈｏｔ，２０１６）。??现在证实ＵＰＳ是激素信号调节中心（Ｓａｄａｎａｎｄｏｍｅｔａｌ．，２０１２），如图２所??４??

ａｓｅ－ｒｅｅ２｜ｉＴｏｔａｌ?２０?｜ｉＬ??°Ｃ，１５ｍｉｎ?；?８５°Ｃ，５?ｓ，稍离心，－２０°Ｃ保存备用。??不同组织ｃＤＮＡ稀释成相同浓度作为模板，用／／－Ｆ＼?５；－ＧＣＴＣＧＡＡＧＡＣＧＡＴＣＡＧＡＴＡＣＣ－３；，Ｈｂｌ８ＳｒＲＮＡＧＡＣＣＡＴＡＣ－３，）作内参基因（Ｃｈａｏ?ｅｔ?ａｌ．，２０１６）进行?，进行电泳检测，保存结果。??体系如下：??ｃＤＮＡ?１??２＞＜ＴａｑＭｉｘ?９?ｊｘＬ??Ｈｂｌ８ＳｒＲＮＡ－Ｆ?１??Ｈｂｌ８ＳｒＲＮＡ－Ｒ?１??ｄｄ?Ｈ２０?８（ｘＬ??Ｔｏｔａｌ?２０?（ｊ，Ｌ??程序如下：??ｉ??＾３０?ｃｙｃｌｅｓ?ｉ??
【参考文献】

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1 覃碧;刘长仁;杜磊;;橡胶树死皮(TPD)发生过程中胶乳蛋白质的泛素化[J];植物生理学报;2013年03期

2 曾日中,段翠芳,黎瑜,郝秉中;茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析[J];热带作物学报;2003年03期

3 刘惠芳,吴继林,郝秉中;茉莉酸和其它激素对巴西橡胶树乳管分化的协同作用[J];热带作物学报;2001年03期

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本文编号：2849128