调控油松胚珠雌配子体游离核分裂相关基因筛选及初步功能鉴定
发布时间：2021-02-15 10:01
雌配子体是胚珠的核心结构,雌配子体游离核分裂期是胚珠发育过程中的关键时期。核分裂的失败将阻碍雌配子体的成熟和卵细胞的产生,可导致植株的雌性不育现象。所以,对该时期胚珠发育的分子调控机制进行研究,具有重要的理论和实践意义。目前,调控胚珠发育的分子机制已见报道,但主要围绕被子植物展开,对裸子植物的相关研究较少。而裸子植物的胚珠发育与被子植物不同,特别是木本植物,其差异更加明显。本论文以辽宁兴城油松种子园中28号雌性不育系和可育系油松胚珠为材料,在前人研究的基础上采用抑制性消减杂交（supression subtractive hybridization,SSH）文库建立技术,和转录组高通量测序（RNA-seq）技术,辅以生物信息学等研究手段,对油松可育系（fertile line,FL）和不育系（sterile line,SL）在雌配子体游离核有丝分裂不同时期的胚珠差异表达基因进行研究,筛选功能性候选基因,以揭示雌配子体游离核有丝分裂的分子调控机制。主要研究结果如下:1.通过建立油松可育系与不育系胚珠正向与反向cDNA消减文库,分析了游离核有丝分裂时期雌性可育系与不育系的差异表达基因。从两...
【文章来源】：北京林业大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图３－〗油松胚珠总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测结果，ＦＬ：可育系；ＳＬ：不育系
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过蓝白斑筛选，获得大量阳性克隆，比率约为７０％。随机挑取菌落进行克隆，数量??共计７５６个，然后进行ＰＣＲ扩增，检测插入片段，通过菌液ＰＣＲ进行测序前的预??检测，筛除具有多个扩增子的菌液样品，或没有扩增子的菌液样品。图３－４中所示??为其中的１０个检测结果，条带多处于１５０－８００范围内。经ＰＣＲ筛选，１８个克隆??（２．４％）由于出现多个插入片段被排除，剩余的转录本被送至上海生工进行测序。??２〇〇〇ｂｐ－＾？：Ｖ?．?－?－?Ｙ??ｉ?ｏｏｏｂｐ—？??７５０ｂｐ—？?．??ｓｏｏｂｐ—國??２Ｓ０ｂｐ?？?■??１?—Ｐ—丄？；蓉遽??图３－４菌液ＰＣＲ检测插入片段??Ｆｉｇ．?３－４?Ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｉｎｓｅｒｔｅｄ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ?ｂｙ?ｆｕｎｇｕｓ?ｌｉｑｕｉｄ?ＰＣＲ??３．２．２阳性克隆ＥＳＴ片段测序??将过夜培养的菌液送至上海生工公司进行ｓａｎｇｅｒ测序，在去除低质量序列数??据、载体和接头序列后，共计得到７０１条高质量表达序列标签（Ｅｘｐｒｅｓｓ?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ??Ｔａｇｓ，?ＥＳＴｓ），长度由?１０５?ｂｐ?到?７６３?ｂｐ。??３．２．３生物信息学分析??ｃＤＮＡ消减文库包含上调和下调（可育系ｖｓ不育系）表达的基因。将所得到??的?ＥＳＴ?对?ＥＢＩ?ＵｎｉＰｒｏｔ?Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ?数据库进行?ＢＬＡＳＴＸ?检索，在?７０１?条?ＥＳＴ??中，其中４３０条（６１．３％）序列与数据库中的条目具有高度相似性（Ｅ值低于１０＿??４）
【参考文献】：
期刊论文
[1]An embryological study and systematic significance of the primitive gymnosperm Ginkgo biloba[J]. 1,2Li WANG 1Di WANG 1Ming-Ming LIN 1Yan LU 1Xiao-Xue JIANG 1Biao JIN 1(College of Horticulture and Plant Protection,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China) 2(Key Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100093,China). Journal of Systematics and Evolution. 2011(04)
[2]GAMETOPHYTIC FACTOR 1,Involved in Pre-mRNA Splicing,Is Essential for Megagametogenesis and Embryogenesis in Arabidopsis[J]. Man Liu1,2,Li Yuan1,2,Nai-You Liu1,2,Dong-Qiao Shi1,Jie Liu1 and Wei-Cai Yang1(1Key Laboratory of Molecular and Developmental Biology,National Center for Plant Gene Research,Institute of Genetics and Developmental Biology,the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China;2Graduate University,the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China). Journal of Integrative Plant Biology. 2009(03)
[3]油松雌性不育系的POD同工酶和蛋白质多肽分析[J]. 丁坤善,郑彩霞,包仁艳. 西北植物学报. 2004(01)
[4]茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析[J]. 曾日中,段翠芳,黎瑜,郝秉中. 热带作物学报. 2003(03)
[5]Anatomic Study of Female Sterility of Pinus tabulaeformis Carr.[J]. Cheng Pengjun Li Fenglan Zheng CaixiaCollege of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China. Forestry Studies in China. 2003(01)
[6]油松雌性不育系（28号无性系）的RAPD分析[J]. 李敏俐,郑彩霞. 北京林业大学学报. 2002(04)
[7]白杄两性孢子叶球的胚胎学研究[J]. 苏建英,王黎元. 阴山学刊. 1999(06)
[8]银杏大孢子形成的超微结构研究[J]. 吉成均,杨雄,李正理. 植物学报. 1999(12)
[9]攀枝花苏铁（Cycas Panzhihuaensis L.Zhou et S.Y.Yang）生殖生物学特性研究——大孢子发生、受精前雌配子体及颈卵器的发育[J]. 李平,李旭峰,杜林方,吴先军. 四川大学学报(自然科学版). 1998(05)
[10]苏铁类的生殖周期[J]. 杜桂森. 生物学通报. 1997(11)
博士论文
[1]油松雌配子体发育过程中SLOW WALKER2基因表达的研究[D]. 郭爱.北京林业大学 2013
[2]油松雌配子体游离核有丝分裂的细胞学研究[D]. 杨远媛.北京林业大学 2008
[3]油松胚珠雌配子体发育阶段的细胞及生化研究[D]. 贺窑青.北京林业大学 2007
[4]油松雌性不育系胚珠败育机制的初步研究[D]. 包仁艳.北京林业大学 2006
硕士论文
[1]油松胚珠雌配子体游离核时期的组织特异表达基因研究[D]. 陈彬丽.北京林业大学 2015
[2]油松胚珠雌配子体LCM分离技术的建立及相关RNA的检测[D]. 王英旗.北京林业大学 2013
[3]油松胚珠游离核时期消减杂交文库的构建[D]. 徐利利.北京林业大学 2010
[4]油松胚珠游离核分裂期miRNA的克隆与初步鉴定[D]. 赵百慧.北京林业大学 2010
[5]油松雌配子体细胞化过程的形态学及组织化学研究[D]. 周丽红.北京林业大学 2007
本文编号：3034634
【文章来源】：北京林业大学北京市 211工程院校 教育部直属院校
【文章页数】：111 页
【学位级别】：博士
【部分图文】：
图３－〗油松胚珠总ＲＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测结果，ＦＬ：可育系；ＳＬ：不育系
??图３－２油松胚珠ｃＤＮＡ扩增结果。ＦＬ：可育系；ＳＬ：不育系??Ｆｉｇ．?３－２?ｃＤＮＡ?ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ?Ｒｅｓｕｌｔｓ?ｏｆ?Ｐｉｎｕｓ?ｔａｂｕｌａｅｆｏｒｍｉｓ?ｏｖｕｌｅｓ??３．１．３ＲｓａＩ酶切处理??经酶切后，分别将可育系与不育系油松胚珠ｃＤＮＡ酶切前和酶切后的样品通过??琼脂糖凝胶电泳检测，ｃＤＮＡ条带呈弥散状，经酶切的ｃＤＮＡ在长度上较未经酶切??ｃＤＮＡ样品更小。??３．１．４消减杂交效率检测??消减杂交效率直接影响消减文库的质量，较高的消减杂交效率会增加差异表达??转录本的含量，降低筛选差异表达转录本的难度。从图３－３中可发现转录??本的含量在消减后有明显的下降。在消减后ｃＤＮＡ扩增中，７Ｉ／５ｔ／Ｚ／７Ｖ扩增产物在??２３个循环时被观察到；而在未消减ｃＤＮＡ中，扩增产物在１８个循环时己被观察??至ＩＪ。结果表明基因的含量在消减后被降低了高达２５倍，说明消减杂交过??程成功完成
过蓝白斑筛选，获得大量阳性克隆，比率约为７０％。随机挑取菌落进行克隆，数量??共计７５６个，然后进行ＰＣＲ扩增，检测插入片段，通过菌液ＰＣＲ进行测序前的预??检测，筛除具有多个扩增子的菌液样品，或没有扩增子的菌液样品。图３－４中所示??为其中的１０个检测结果，条带多处于１５０－８００范围内。经ＰＣＲ筛选，１８个克隆??（２．４％）由于出现多个插入片段被排除，剩余的转录本被送至上海生工进行测序。??２〇〇〇ｂｐ－＾？：Ｖ?．?－?－?Ｙ??ｉ?ｏｏｏｂｐ—？??７５０ｂｐ—？?．??ｓｏｏｂｐ—國??２Ｓ０ｂｐ?？?■??１?—Ｐ—丄？；蓉遽??图３－４菌液ＰＣＲ检测插入片段??Ｆｉｇ．?３－４?Ａｎａｌｙｓｉｓ?ｏｆ?ｉｎｓｅｒｔｅｄ?ｆｒａｇｍｅｎｔｓ?ｂｙ?ｆｕｎｇｕｓ?ｌｉｑｕｉｄ?ＰＣＲ??３．２．２阳性克隆ＥＳＴ片段测序??将过夜培养的菌液送至上海生工公司进行ｓａｎｇｅｒ测序，在去除低质量序列数??据、载体和接头序列后，共计得到７０１条高质量表达序列标签（Ｅｘｐｒｅｓｓ?Ｓｅｑｕｅｎｃｅ??Ｔａｇｓ，?ＥＳＴｓ），长度由?１０５?ｂｐ?到?７６３?ｂｐ。??３．２．３生物信息学分析??ｃＤＮＡ消减文库包含上调和下调（可育系ｖｓ不育系）表达的基因。将所得到??的?ＥＳＴ?对?ＥＢＩ?ＵｎｉＰｒｏｔ?Ｋｎｏｗｌｅｄｇｅｂａｓｅ?数据库进行?ＢＬＡＳＴＸ?检索，在?７０１?条?ＥＳＴ??中，其中４３０条（６１．３％）序列与数据库中的条目具有高度相似性（Ｅ值低于１０＿??４）
【参考文献】：
期刊论文
[1]An embryological study and systematic significance of the primitive gymnosperm Ginkgo biloba[J]. 1,2Li WANG 1Di WANG 1Ming-Ming LIN 1Yan LU 1Xiao-Xue JIANG 1Biao JIN 1(College of Horticulture and Plant Protection,Yangzhou University,Yangzhou 225009,China) 2(Key Laboratory of Photosynthesis and Environmental Molecular Physiology,Institute of Botany,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100093,China). Journal of Systematics and Evolution. 2011(04)
[2]GAMETOPHYTIC FACTOR 1,Involved in Pre-mRNA Splicing,Is Essential for Megagametogenesis and Embryogenesis in Arabidopsis[J]. Man Liu1,2,Li Yuan1,2,Nai-You Liu1,2,Dong-Qiao Shi1,Jie Liu1 and Wei-Cai Yang1(1Key Laboratory of Molecular and Developmental Biology,National Center for Plant Gene Research,Institute of Genetics and Developmental Biology,the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China;2Graduate University,the Chinese Academy of Sciences,Beijing 100049,China). Journal of Integrative Plant Biology. 2009(03)
[3]油松雌性不育系的POD同工酶和蛋白质多肽分析[J]. 丁坤善,郑彩霞,包仁艳. 西北植物学报. 2004(01)
[4]茉莉酸刺激的橡胶树胶乳cDNA消减文库的构建及其序列分析[J]. 曾日中,段翠芳,黎瑜,郝秉中. 热带作物学报. 2003(03)
[5]Anatomic Study of Female Sterility of Pinus tabulaeformis Carr.[J]. Cheng Pengjun Li Fenglan Zheng CaixiaCollege of Biological Sciences and Biotechnology, Beijing Forestry University, Beijing 100083, P. R. China. Forestry Studies in China. 2003(01)
[6]油松雌性不育系（28号无性系）的RAPD分析[J]. 李敏俐,郑彩霞. 北京林业大学学报. 2002(04)
[7]白杄两性孢子叶球的胚胎学研究[J]. 苏建英,王黎元. 阴山学刊. 1999(06)
[8]银杏大孢子形成的超微结构研究[J]. 吉成均,杨雄,李正理. 植物学报. 1999(12)
[9]攀枝花苏铁（Cycas Panzhihuaensis L.Zhou et S.Y.Yang）生殖生物学特性研究——大孢子发生、受精前雌配子体及颈卵器的发育[J]. 李平,李旭峰,杜林方,吴先军. 四川大学学报(自然科学版). 1998(05)
[10]苏铁类的生殖周期[J]. 杜桂森. 生物学通报. 1997(11)
博士论文
[1]油松雌配子体发育过程中SLOW WALKER2基因表达的研究[D]. 郭爱.北京林业大学 2013
[2]油松雌配子体游离核有丝分裂的细胞学研究[D]. 杨远媛.北京林业大学 2008
[3]油松胚珠雌配子体发育阶段的细胞及生化研究[D]. 贺窑青.北京林业大学 2007
[4]油松雌性不育系胚珠败育机制的初步研究[D]. 包仁艳.北京林业大学 2006
硕士论文
[1]油松胚珠雌配子体游离核时期的组织特异表达基因研究[D]. 陈彬丽.北京林业大学 2015
[2]油松胚珠雌配子体LCM分离技术的建立及相关RNA的检测[D]. 王英旗.北京林业大学 2013
[3]油松胚珠游离核时期消减杂交文库的构建[D]. 徐利利.北京林业大学 2010
[4]油松胚珠游离核分裂期miRNA的克隆与初步鉴定[D]. 赵百慧.北京林业大学 2010
[5]油松雌配子体细胞化过程的形态学及组织化学研究[D]. 周丽红.北京林业大学 2007
本文编号：3034634
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