转录组及microRNA测序分析和阐明野葛幼根响应硒刺激的分子机制

发布时间：2020-09-09 10:49

　　 硒是一种重要的微量元素,存在于动物、植物和微生物中并且是动物和人体中谷胱甘肽过氧化物酶等的活性成分,具有抗氧化、抗衰老、提高人体免疫力等作用。不过食用硒也要适量,因为过量摄入会导致中毒,出现脱发、脱甲等现象。目前对硒元素的研究,主要集中在资源分布、富硒栽培、在植物中存在的形式以及其对植物生理生化的影响等方面,而在植物富硒分子机理方面研究较少。野葛(Pueraria lobata(willd.)Ohwi),为豆科葛属多年生植物,是一种大宗重要中药材,于2002年被国家卫生部认定为药食两用植物,也是一种富硒植物。野葛以其干燥的根入药,称为葛根,具有提高大脑记忆力、改善和治疗心脑血管疾病等功效,其主要生物活性成分为异黄酮类化合物。本研究首先通过使用不同浓度亚硒酸钠处理野葛幼苗,接着测定植株中硒含量和部分生理指标,筛选出最适的亚硒酸钠浓度。然后借助转录组技术研究亚硒酸钠作用下野葛中蛋白质编码基因的差异表达情况,明确差异表达基因所在的信号通路及其表达模式,根据注释信息找到硒代谢和异黄酮代谢相关的编码基因。最后利用小RNA测序技术揭示了亚硒酸钠作用下野葛microRNA(miRNA)及其靶基因的差异表达情况,从而揭示野葛幼根响应硒刺激的分子机制,为深入研究富硒野葛提供理论依据。本研究主要结果如下:1.用不同浓度的亚硒酸钠溶液处理野葛幼苗,然后测定植株中的硒含量,初步明确了随着亚硒酸钠浓度的升高,葛根幼苗叶和茎中硒的含量表现为先增高后降低的模式,并在25 mg/L的浓度时植株中硒的含量达到最大值。2.根据硒含量测定结果,使用6种不同浓度的亚硒酸钠溶液处理野葛幼苗,然后测量根长,可溶性糖、丙二醛的含量,以及超氧化物歧化酶的活性,综合以上结果,明确了适宜的亚硒酸钠溶液处理浓度为25 mg/L。3.用25 mg/L浓度的亚硒酸钠溶液处理野葛幼苗,设置三次生物学重复,分别于处理后第0、1、3、5、7、9天采集野葛幼根,使用改良的Trizol法提取RNA,建立转录组文库,再利用Illumina HiSeq X ten平台进行测序,获得了 18个碱基数目分别大于6,200,000,000 nt的文件。使用Trimmomatic软件质控后,再经过Trinity软件拼接共得到323,717个转录本,聚类去冗余后保留最长的序列,得到150,567条平均长度为624.31 bp的Unigene,其N50为1,135 bp,平均GC含量大于46%。接着对测序组装的Unigene序列进行功能注释,发现有59,266、64,759、5,416、58,101、33,401、31,796 个基因分别在 NR、GO、KEGG、Swissprot、KOG和Pfam等数据库得到了注释。在KEGG数据库中,共有9,746个基因在23个二级目录下的215个途径中得到了识别,其中包括29个硒代谢相关基因和41个异黄酮及其上游合成途径基因。以0天作为对照,共获得了 4,246个差异表达编码基因,硒代谢途径中有19个基因差异表达,而在异黄酮及其上游途径中则有9个基因差异表达,并且这9个基因均为上调表达。本研究将转录因子与硒代谢途径和异黄酮代谢途径基因进行共表达分析,以|R|0.75为阈值,发现了301个转录因子与硒代谢基因相关,341个转录因子与异黄酮代谢基因相关。4.使用Illumina HiSeq X ten平台进行小RNA测序。再使用psRobot的软件共鉴定出88个保守miRNAs,它们属于26个miRNA家族;以及166个非保守miRNAs,它们属于118个miRNA家族。对这些miRNAs进行靶基因预测,以期望值小于3.0为阈值,预测出了 2541个靶基因。对差异表达miRNA的靶基因进行功能富集后发现:GO富集分析中前五位分别为“integral component of membrane”、“nucleus”、“ATP binding”、“transcription,DNA-templated”和“plasma membrane”;KEGG富集分析显示125个差异表达miRNAs的靶基因富集到了 74条代谢途径上,其中有69、23、20、13个靶基因分别富集到了“Metabolism”、“Genetic Information Processing”、“Environmental Information Processing”和“Cellular Processes”四个大类中,表明了野葛在亚硒酸钠溶液处理后,幼根内差异表达miRNA靶基因应答具有复杂性。
【学位单位】：北京协和医学院
【学位级别】：硕士
【学位年份】：2019
【中图分类】：S567.239
【部分图文】：

逡逑我们对葛根幼苗处理第七天时叶和茎中的硒含量进行了检测，如图２所示，逡逑我们发现随着亚硒酸盐处理浓度的升高，葛根幼苗叶和茎中砸的积累量整体上呈逡逑现出先增加后降低的趋势，且茎中的硒含量小于叶中的硒含量。在处理浓度为逡逑０．０５－５邋ｍｇ／Ｌ时，葛根幼苗叶和茎中硒的积累量较低，分别为１．３和０．７邋Ｈｇ／ｇ，在逡逑处理浓度为５－２５邋ｍｇ／Ｌ时，葛根幼苗叶和茎中硒的积累量较高，且在处理浓度为逡逑２５邋ｍｇ／Ｌ时达到最高，分别为５．７和２．５邋｜ｉｇ／ｇ，随后葛根幼苗中硒的积累量开始降逡逑低。逡逑６．０逡逑＿逦Ｏ叶逡逑１１茎逡逑５．０逦■逡逑＾邋４０逦＿逦．逦Ｉ逡逑＇Ｓｎ逡逑３邋３．０逦■逡逑ｍ逦■逦■■逡逑２．０逦■逦Ｉ逦ｌｌ逦ｌｌ逦■逡逑＇ｆＣ逦ｎ邋ｒ－ｉ逦

本文编号：2814878