山东省贝类弧菌病流行病学调查及副溶血弧菌快速检测方法的建立

发布时间：2020-03-30 14:11

【摘要】：山东省贝类资源丰富,养殖面积广阔,约占海水养殖面积的66%,年产量约占全省海水养殖总产量的80%,居各类水产品首位。近几年来,伴随着沿海经济的高速发展,环境污染问题越来越严重,生态养殖系统遭到了严重破坏,微生物病害也日趋泛滥,某些地区养殖贝类出现了严重的死亡现象,生态养殖生产受到了严重的阻碍。每年夏季的7-8月份是养殖贝类微生物病害流行爆发的季节,其中弧菌(Vibrio)是养殖贝类中的主要病原菌之一。因此,了解山东省主要经济贝类中弧菌的流行情况,并建立简便、快速检测方法显得尤为重要。通过对山东沿海各养殖海区及相邻地区的主要养殖经济贝类养殖地区进行调查,发现了大量贝类死亡的现象。本试验采集了潍坊的羊口,东营的垦利、刁口、广利,烟台的招远、莱州以及日照、青岛、威海等地方的主要养殖经济贝类及野生贝类。通过细菌分离、生化鉴定、16SrDNA的克隆以及序列分析。结果:共采集各地样品的68份,其中主要养殖经济贝类44份、野生贝类24份;从样品中共分离细菌151株,可分为溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)、哈氏弧菌(Vibrio harveyi)、副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、塔氏弧菌(Vibrio tubiashii)、创伤弧菌(Vibrio vulnificus)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)等,弧菌分离率高达96%;弧菌中哈氏弧菌的分离率最高为24%,其次是溶藻弧菌为21%;哈氏弧菌和副溶血性弧菌采样分离主要在东营、烟台等地,溶藻弧菌主要在青岛、威海等地;另外,哈氏弧菌主要分离自扇贝、花蛤、毛蚶等品种,副溶血弧菌主要分离自花蛤、毛蚶中,溶藻弧菌主要分离自魁蚶、牡蛎中,其中哈氏弧菌在各贝类中较为普遍。试验结果表明:哈氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血性弧菌是山东省经济贝类弧菌病的主要病原菌之一,对扇贝(Scallop)、牡蛎(Ostrea gigas thunberg)、毛蚶(Scapharca subcrenata)、魁蚶(Scapharca broughtonii)、花蛤(Ruditapes philippinarum)危害严重;弧菌病主要发生在7-8月份的高温季节,这与细菌的最适生长温度一致。食品安全国家标准中规定了食品中副溶血性弧菌的检测方法,可见国家对其重视。试验主要目的是建立一种贝类副溶血性弧菌的快速检测方法,不仅保证了食品安全,也便于贝类副溶血性弧菌病的检测。试验对副溶血性弧菌的不耐热溶血毒素基因tlh设计了三对特异性引物(内引物、外引物、环引物),根据环介导等温扩增技术(Loop mediated isothermal amplification,LAMP)原理进行扩增。对20株副溶血性弧菌和20株其它弧菌进行了扩增,结果显示LAMP检测方法特异性很强,与普通PCR检测方法对照,也显示出很高灵敏性,达到88fg/LAMP,高出近100倍。因此,研究表明,LAMP检测方法灵敏度高、特异性强,并且耗时短(约1h)、操作简单,成为快速检测贝类副溶血弧菌的一种有效方法。
【图文】：

示意图,反应原理,示意图,产物

山东省贝类弧菌病流行病学调查及副溶血弧菌快速检测方法的建立形成结构（13），另→个重复（8）-（10）的过程，生成产物（14）和（15）；产物再以自身为模板，3，端自动引导链置换 DNA 的合成，，生成产物，（16）和最初的（8），产物（8）开始新一轮的循环扩增，产物（16）进入延伸循环步骤，形成结构（内部引物又可以产物（13）和（17）作为模板，引导链置换 DNA 的合成，使产物列不断延伸、环化、再延伸，最终的产物是一些具有不同茎长度茎环结构的 DNA有许多环的结构的 DNA 的混合物。

序列,引物设计,区段

山东省贝类弧菌病流行病学调查及副溶血弧菌快速检测方法的建立正向内引物 FIP：（Forward Inner Primer）该引物是由位于 3’端的 F2 区段和位于 5端的 F1c 区段组成的，分别与靶基因的 F2c 区段以及靶基因的 F1c 序列互补，两个区段之间可以直接连接也可加入酶切位点。反向内引物 BIP：（Backward Inner Primer）该引物是由位于 3’端的 B2 区段和位于5’端的 B1c 区段组成的，分别与靶基因的 B2c 区段以及靶基因的 B1c 序列互补，两个区段之间可以直接连接也可加入酶切位点。正向环引物 LF：（Forward loop Primer）该引物的位置是在 F2 区段和 F1 区段之间的区域，并且是以从 F1 到 F2 的方向来结合的。反向环引物 LB：（Backward loop Primer）该引物的位置是在 B2 区段和 B1 区段之间的区域，并且是以从 B1 到 B2 的方向来结合的。
【学位授予单位】：山东农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S944

【参考文献】