条斑紫菜（Pyropia yezoensis）的病害调查及其绿斑病病原的PCR检测方法

发布时间：2020-04-05 04:44

【摘要】：紫菜是我国海藻产业的重要组成部分,随着栽培产量和密度的增加,紫菜病害发生严重,成为重影响产业发展的瓶颈。我国紫菜病害研究起步较晚、基础薄弱,病害种类和病原种类不清楚,病害发生机制不明,病害防控手段缺乏,各方面的工作亟待开展。本文初步调查了条斑紫菜(Pyropia yezoensis)苗期和栽培期的病害,分离鉴定了苗期贝壳丝状体的可培养微生物,进一步分析了贝壳丝状体黄斑病的发病过程和病原种类;建立了一种紫菜绿斑病病原的PCR检测方法。本论文研究结果将为我国紫菜流行病学研究提供数据和支撑。具体研究内容和结果如下:1.条斑紫菜苗期和栽培期的病害调查。从2017年8月至2019年1月,对江苏、浙江、山东的十多个养殖场开展病害调查。育苗期间,多数育苗场都不同程度发生病害,出现黄斑、白斑、鲨皮等病征,以黄斑病最常见,其次为白斑病,有的养殖池同时发生两种病,发病严重的可导致整个养殖场绝收。发病和未发病育苗池的水质理化指标未见显著性差异。栽培期间,赤腐病、拟油壶菌病最常见。在两个发病海区鉴定了两种卵菌病原,分别为腐霉Pythium chondricola、拟油壶菌Olpidiopsis pyropia。2.紫菜育苗期可培养微生物的分析。对2017年9月及2018年10月采集的黄斑病及未发病的育苗池水和贝壳丝状体可培养微生物进行分离鉴定,共分离得到79属细菌571株,5属放线菌8株,未分离到真菌。可培养微生物丰度依次为:变形菌门Proteobacteria(81.28%)、拟杆菌门Bacteroidetes(10.25%)、厚壁菌门Firmicutes(6.55%)、放线菌门Actinobacteria(1.92%)。比较患黄斑病和未发病样品的细菌种类,发现患病样品分离到的弧菌科(Vibrionaceae)、红杆菌科(Rhodobacteraceae)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae)、盐单胞菌科(Halomonadaceae)、假交替单胞菌科(Pseudoalteromonadaceae)、海洋螺菌科(Oceanospirillaceae)的细菌明显多于未发病样品,未发病样品的红螺菌科(Rhodospirillaceae)和赤杆菌科(Erythrobacteraceae)的细菌明显多于发病样品。对上述菌株的胞外酶产生情况进行分析,发现产生酪蛋白酶、明胶酶、淀粉酶、脂肪酶、琼胶酶的有319株、377株、288株、35株、5株,未见有产果胶酶和纤维素酶的菌株。发现从患黄斑病样品分离得到的菌株多数产生酪蛋白酶、淀粉酶、明胶酶和琼胶酶酶活。3.条斑紫菜丝状体贝壳溶壳条件的筛选。生产上常用溶壳剂溶解紫菜贝壳丝状体来获取丝状体,用以观察紫丝状体的生长和发育情况。为了减少溶壳剂作用强度对丝状体的影响,本研究比较了柏兰尼液和醋酸(7%、10%、15%和20%)两种溶壳剂在不同作用浓度和不同作用时间的溶壳效果、对丝状体形态变化和损伤的影响。结果显示,柏兰尼液的溶壳效果最好,其作用时间为90 s时,对丝状体形态变化和损伤影响最轻。4.条斑紫菜贝壳丝状体黄斑病的病程观察和可疑病原的确定。将患病贝壳丝状与正常条斑紫菜贝壳丝状体共同培养,7天后可观察到正常贝壳出现零星几个针尖大小的黄色斑点,随着感染时间增加,黄色斑点数量逐渐增加、直径逐渐增大,一般在5-7周病斑出现爆发式增加,病斑可渐渐增大至2mm左右。在显微镜下观察,发病丝状体经历棕红色、橙色、黄色的变化,最后藻丝崩解、内容物消失。从患黄斑病样品分离得到的菌株中选择17株,回接感染条斑紫菜贝壳丝状体和自由丝状体,有5株菌菌株(Ruegeria,Roseovarius,Marinomonas,Maribacter,Flavobacterium)能引起丝状体出现黄斑的症状。5.条斑紫菜绿斑病病原PCR检测方法的建立。针对条斑紫菜绿斑病病原假交替单胞菌Pseudoalteromonas tbzcY1的dnaA和dnaN基因,选择保守区设计2对简并引物pw-dnaA和pw-dnaN1,扩增片段分别为1258和1054 bp,通过16S rRNA、dnaA和dnaN基因序列的进化分析比较,确定tbzcY1属于海假交替单胞菌(Pseudoalteromonas marina)。选择高变区设计3对特异引物pws-dnaA2、pcs-dnaN2、pws-dnaN13,扩增片段分别为386、253、721 bp,进行特异性和灵敏性试验。结果表明这3对引物均能特异性从22种其他海水细菌中检测到P.marina,其中pws-dnaA2灵敏度最高,检测下限为每反应4 CFU细菌或23.7 fg细菌基因组DNA。P.marina人工侵染条斑紫菜引起绿斑病显微症状后,3对引物均能检出该病原。上述结果表明该方法可用于检测由P.marina引起的条斑紫菜绿斑病。
【图文】：

紫菜,有性生殖,生活史,阶段

紫菜生活史a为有性生殖阶段；b为无性生殖阶段[40]

紫菜,日期,地点,指标测定

图 2-1 紫菜病害调查地点及日期Fig. 2-1 Investigation region and date of Pyropia disease指标测定
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S946.2

【相似文献】