【摘要】：莫荷罗非鱼“广福1号”可在盐度为0~30‰的水体中生长,在耐盐碱方面与亲本相比具有明显的杂种优势。本研究从DNA甲基化角度分析了杂交种“广福1号”与亲本基因组DNA的甲基化差异以及这种差异是否与杂种优势有关。通过甲基化差异片段筛选获得prkaca基因,并对该基因进行序列结构分析以及在盐碱胁迫下的组织表达分析,初步了解prkaca基因的功能。利用BSP技术进一步分析prkaca基因启动子甲基化水平与该基因表达变化之间的关系。研究结果在杂交新品种莫荷罗非鱼“广福1号”表观分子标记筛选及罗非鱼耐盐碱胁迫相关基因的功能研究方面具有重要的意义。1.莫荷罗非鱼“广福1号”与亲本基因组DNA的甲基化差异分析以橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼及其杂交种莫荷罗非鱼“广福1号”为研究对象,运用甲基化敏感扩增多态技术(Methylation Sensitive Amplified Polymorphism,MSAP)分析亲、子代罗非鱼在皮肤、肌肉和鳃等11种组织的DNA甲基化水平差异及甲基化模式的变化。实验结果显示:莫荷罗非鱼“广福1号”与亲本在不同组织间的甲基化水平存在组织特异性,相同组织在不同亲、子代罗非鱼间的甲基化程度亦存在差异;橙色莫桑比克罗非鱼、荷那龙罗非鱼以及莫荷罗非鱼“广福1号”各组织平均总甲基化水平分别为38.03%、32.21%和29.77%,“广福1号”的总甲基化水平低于双亲;莫荷罗非鱼“广福1号”有75.08%胞嘧啶位点的甲基化模式与亲本相同,24.92%胞嘧啶位点发生去甲基化和超甲基化,且发生去甲基化的位点数(E类型,15.73%)多于超甲基化位点数(D类型,9.19%)。此外,通过甲基化差异片段分析筛选获得prkaca基因,并把prkaca基因作为下一步研究的目的基因。2.莫荷罗非鱼“广福1号”prkaca基因的克隆和组织表达分析蛋白激酶A(PKA)是由调节(R)亚基二聚体和两个催化(C)亚基二聚体组成的四聚体。当第二信使cAMP与R亚基结合时,会导致PKA全酶的构象发生变化以释放C亚基而发挥生物学作用。prkaca基因是蛋白激酶A(PKA)家族的一员,编码PKA的催化亚基。以尼罗罗非鱼的prkaca基因序列为模板设计引物,获得母本橙色莫桑比克罗非鱼、父本荷那龙罗非鱼和莫荷罗非鱼“广福1号”prkaca基因完整的cDNA序列。cDNA全长4975bp,包含1056bp开放阅读框,编码351个氨基酸。氨基酸结构域预测分析结果显示:罗非鱼的Prkaca氨基酸序列存在一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶催化结构域(S_TKc)和一个丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶延伸结构域(S_TK_X)。氨基酸序列同源性比较表明,亲、子代三种罗非鱼的Prkaca氨基酸序列与尼罗罗非鱼、斑马拟丽鱼和伯氏朴丽鱼氨基酸序列完全一致(100%),与其他鱼类具有93.7%-99.4%的同源性。实时荧光定量PCR结果显示:prkaca基因在母本橙色莫桑比克罗非鱼和父本荷那龙罗非鱼10个组织或器官的表达水平存在明显差异。prkaca基因在脑组织中表达量极显著高于其他各组织或器官(P0.01)。母本橙色莫桑比克罗非鱼、父本荷那龙罗非鱼、莫荷罗非鱼“广福1号”和尼罗罗非鱼经过盐碱胁迫(盐度10,碱度3g//L,S10A3)后,肌肉、鳃、肾脏和脑组织在不同时间点(0 h、24 h、48 h、72 h和96 h)的prkaca基因的表达变化均呈现先显著上升(P0.05)、后显著下降并恢复至处理前水平的一种变化趋势。莫荷罗非鱼“广福1号”的prkaca基因表达量在24 h显著增加,而其亲本基因表达量则在72 h显著增加。由此可见prkaca基因可能参与罗非鱼的渗透压调节,且莫荷罗非鱼“广福1号”在应对水环境盐碱度变化时具有维持体内渗透压平衡的快速应答机制。3.莫荷罗非鱼“广福1号”及亲本prkaca基因DNA甲基化水平分析首先克隆得到prkaca基因组序列,通过PCR获得prkaca基因组DNA全长21207bp,包含11个外显子和10个内含子。通过MethPrimer和JASPAR在线软件分析可能存在的CpG岛,选择含有4个转录因子结合位点的长度为416bp(-544,-129)的启动子序列作为甲基化分析目的片段。一方面,运用重亚硫酸盐(Bisulfite Sequencing PCR,BSP)技术检测莫荷罗非鱼“广福1号”在盐碱胁迫各时间点下肌肉和肾脏组织prkaca基因启动子区域的甲基化水平,并分析其甲基化水平的变化与基因表达之间的关系。以莫荷罗非鱼“广福1号”盐碱胁迫下(S10A3)0 h时的甲基化水平为参照,肌肉组织prkaca基因启动子在24 h和72 h的甲基化水平显著下降(P0.05)和显著上调(P0.05),肾脏组织prkaca基因启动子在48 h的甲基化程度显著高于0 h(P0.05)。结合莫荷罗非鱼“广福1号”盐碱胁迫下prkaca基因表达变化发现DNA甲基化水平与表达水平变化基本呈现负相关。另一方面,分析比较莫荷罗非鱼“广福1号”与亲本prkaca基因启动子区域的甲基化水平差异。子代“广福1号”与亲本在肌肉组织中prkaca基因启动子甲基化水平之间无显著差异(P0.05);肾脏组织中,莫荷罗非鱼“广福1号”prkaca基因的甲基化水平显著低于双亲(P0.05),有可能是杂交种基因组DNA甲基化水平呈现低甲基化的表现形式之一。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4
【参考文献】
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