GCRV弱毒疫苗与黄芪多糖免疫草鱼母本的免疫因子代间传递与表达特性

发布时间：2020-04-12 21:25

【摘要】：草鱼(Ctenopharyngodon idella)是我国大宗淡水鱼类养殖品种。但草鱼病害频发,其中以草鱼呼肠孤病毒(grass carp reovirus,GCRV)感染导致的出血病最为突出,严重制约了草鱼养殖业可持续发展。基于鱼类母源免疫和以黄芪多糖促进草鱼免疫能力提高的研究基础。为探究GCRV弱毒疫苗和黄芪多糖(Astragalus polysaccharides,APS)免疫草鱼母本所产子代3种免疫因子:免疫球蛋白M(immunoglobulin M,IgM)、补体分子3(complement 3,C3)、溶菌酶(lysozyme,LSZ)的表达特性,解析免疫因子在草鱼代间的传递效率。本实验采用ELISA、RT-qPCR等方法检测分析了产前40 d草鱼母本经接种草鱼出血病弱毒疫苗和饲喂黄芪多糖免疫后(以下简称疫苗免疫组和APS免疫组)母本血液、子代胚胎和幼鱼期发育各阶段中三种免疫因子的蛋白活性及基因表达水平;并测定了2月龄鱼种的健康免疫组织和人工感染GCRV后免疫组织中3种免疫因子的基因表达水平以及抵抗GCRV感染的免疫保护作用。结果显示:GCRV弱毒疫苗免疫草鱼母本血液中3种免疫因子蛋白活性和基因表达量均显著高于对照组,疫苗免疫组IgM、C3和LSZ蛋白活性依次为对照组的2.5倍、1.9倍和3.0倍,mRNA水平为对照组的2.5倍、2.2倍和3.0倍;APS免疫组草鱼母本血液中IgM、C3和LSZ的蛋白活性均显著高于对照组,分别提高了2.6倍、1.6倍和2.0倍,APS组IgM mRNA水平高于对照组,但无显著差异,而C3和LSZ的mRNA分别为对照组1.9倍、2.6倍。草鱼两种母源免疫方式所得的胚胎和鱼苗发育阶段中,3种免疫因子蛋白活性呈先下降后升高的趋势,其中IgM蛋白在早期发育各阶段均显著高于对照组。疫苗和APS免疫组的C3、LSZ活性仅在胚胎和鱼苗孵化早期与对照组有显著差异。3个组之中IgM基因的表达水平在发育早期呈先下降后上升的趋势,卵子中,疫苗和APS免疫组IgM基因的表达量分别为对照组的2.6倍和2.4倍,12 h胚胎至5 d仔鱼均未检测到IgM基因表达,14 d仔鱼阶段IgM基因重新开始表达,但无显著差异。C3基因在3个处理组中从3至12 h胚胎期未检测到表达。LSZ基因在3个处理组的卵子至6 h(原肠胚期)呈快速下降趋势,且疫苗免疫组与对照组具有显著差异,而APS免疫组只在卵子和受精卵中与对照组有显著差异。检测2月龄鱼种健康免疫组织IgM、LSZ和C3 mRNA的结果显示,疫苗免疫组子代IgM在免疫组织脾脏、体肾和头肾中与对照组有显著差异,而APS免疫组IgM只在头肾中与对照组具有显著差异。3个组在各免疫组织中C3和LSZ表达无显著差异。GCRV攻毒后,疫苗和APS免疫组2月龄草鱼在脾脏中IgM基因的表达水平呈先上升后下降的趋势。3个组IgM mRNA在72 h表达均达到峰值,疫苗和APS免疫组均为对照组的2.8倍。头肾中24 h表达均达到峰值,疫苗免疫组和APS免疫分别为对照组的4.2倍和4.5倍。疫苗和APS免疫组C3 mRNA水平在脾脏和头肾各时间点均高于对照组,但无显著差异。疫苗免疫组LSZ mRNA在脾脏和头肾与对照组无显著差异,而APS免疫组LSZ mRNA在脾脏和头肾只有0-12h与对照组具有显著差异。GCRV攻毒后,疫苗和APS免疫组子代,出现感染症状晚于对照组,死亡率低于对照组。研究表明,母源免疫可增强免疫因子在草鱼代间传递能力,并对子代在应对GCRV感染时发挥一定免疫保护作用。
【图文】：

种免疫,母本,草鱼,血液

3.1 草鱼母本血液中 3 种免疫因子的蛋白活性与基因表达水平对疫苗免疫组、APS 免疫组和对照组草鱼母本血液中 3 种免疫因子蛋白活性和基因表达水平进行了检测（图 1）。在草鱼母本血液中，疫苗免疫组 IgM、C3 和 LSZ 的蛋白活性均显著高于对照组（P<0.05），分别是对照组的 2.5 倍、1.9 倍和 3.0 倍。AP免疫组 IgM、C3 和 LSZ 的蛋白活性和对照组相比，也均具有显著差异（P<0.05），是对照组的 2.6 倍、1.6 倍和 2.0 倍。疫苗免疫组和 APS 免疫组的 IgM 活性在草鱼母本血液中无显著差异，而疫苗免疫组 C3 和 LSZ 的活性水平均高于 APS 免疫组，且具有显著差异（P<0.05）（图 1-a）。在草鱼母本血液中，疫苗免疫组 IgM、C3 和 LSZ mRNA 表达水平均显著高于对照组（P<0.05），分别提高了 2.5 倍、2.2 倍和 3.0 倍。APS 免疫组母本血液中 IgM mRNA水平高于对照组，但与对照组无显著差异，而 C3 和 LSZ 的 mRNA 的表达水平与对照组相比，均表现出显著差异（P<0.05），分别是对照组的 1.9 倍、2.6 倍。疫苗免疫组和APS 免疫组在 3 种免疫因子的 mRNA 表达水平只有 IgM mRNA 水平具有显著差异（P<0.05），而 C3 和 LSZ 的 mRNA 表达水平无显著差异（图 1-b）。

免疫组织,月龄,草鱼,表达水平

图 2 2 月龄草鱼 IgM、C3 和 LSZ 基因在免疫组织中相对表达水平1. 体肾; 2. 头肾; 3. 脾脏;各免疫因子种不同小写字母者表示显著性差异(P<0.05).n=3; mean±SD.Fig.2 Expression of IgM, C3 and LSZ genes in immune tissues of two months Ctenopharyngodon idella1. trunk kidney; 2. head kidney; 3. spleen;Each of the immune factors values with different small letter superscripts mean significant differences (P<0.05).n=3;mean±SD.3.5 2 月龄草鱼 GCRV 攻毒后 IgM、LSZ 和 C3 基因在不同组织的表达经人工感染 GCRV 后，对 2 月龄草鱼疫苗免疫组、APS 免疫组和对照组中脾脏和头肾中 3 种基因表达水平进行了检测。疫苗免疫组和 APS 免疫组在脾脏中 IgM mRNA的表达水平呈先上升后下降的趋势，而对照组呈先下降后上升再下降趋势。疫苗免疫组在 12 至 72 h 显著高于对照组（P<0.05），而 APS 免疫组在 GCRV 感染 24h 后才与对照组具有显著差异（P<0.05），72 h 3 个组 IgM 基因表达均达到峰值，疫苗免疫组为对照组的 2.8 倍，，APS 免疫组也为对照组的 2.8 倍，而后表达水平有所下降，但疫苗免疫组和 APS 免疫组仍与对照组具有显著差异（P<0.05），且疫苗免疫组在 24 h、48 h
【学位授予单位】：湖南农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943

【参考文献】