Ⅵ型分泌系统在副溶血性弧菌种内竞争中的作用初探

发布时间：2020-04-13 03:14

【摘要】：副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus,Vp)是一种在水产品中常见的机会性致病菌,主要分布在海洋、海口和河口沉积物中,能够黏附在鱼、虾、贝类等水产品的体表,导致水产品弧菌病,危害水产品养殖业。人类误食被副溶血性弧菌污染的水产品后可以引发食物中毒,由该菌引起的食物中毒事件在全世界范围内频繁发生,该菌已经被认为是微生物性食物中毒的主要病原菌之一。副溶血性弧菌具有众多的致病因子,溶血素、脲酶、黏附因子、分泌系统等都在其致病性中发挥着不同的作用。目前对于副溶血性弧菌分泌系统的研究还不成熟,对于副溶血性弧菌的全基因组测序可知副溶血性弧菌存在两套T3SS和两套T6SS。对于其在临床和环境分离株中的分布研究大多仅限于结构基因,而分泌系统主要发挥作用的是其效应蛋白,而对于效应蛋白基因在其中的分布情况还知之甚少。而T6SS被认为是介导细菌种内竞争的因素,在副溶血性弧菌中种内竞争是否普遍存在,以及T6SS在副溶血性弧菌种内竞争中的作用研究还不明确。本文进行了如下的研究工作:(1)探究食品与临床分离的副溶血性弧菌分泌系统相关基因携带情况;(2)探究携带不同分泌系统的菌株在混合培养下的生长差异;(3)探究温度、培养时间及接种量对混合培养条件下副溶血性弧菌种内竞争的影响;(4)探究混合培养对于T6SS相关基因表达量的影响。本研究的主要内容和研究结果如下:1.副溶血性弧菌T6SS和T3SS相关基因在副溶血性弧菌中的分布运用PCR技术对85株不同来源的副溶血性弧菌(44株临床分离株、41株环境分离株)的T6SS相关基因以及T3SS相关基因进行检测,分析其致病基因的携带情况。结果显示,所有菌株均携带T3SS1结构基因和T6SS2结构基因。在所测85株菌中34株含有全部所测T6SS基因,其中32株为tdh~+菌株(包含tdh~+/trh~+和tdh~+/trh~-基因型),2株tdh~-菌株(tdh~-/trh~+和tdh~-/trh~-),T6SS1基因簇在不同菌株中具有多样性。tdh~+菌株携带T3SS2的占80%,而tdh~-菌株中并不含有T3SS2基因。临床分离株中大多为同时携带T3SS2和T6SS1结构基因的菌株,而环境株中多为同时不携带两种基因的菌株。并且,携带T3SS2与T6SS1结构基因的菌株基本都携带tdh基因,tdh~+菌株与tdh~-菌株在T3SS2与T6SS1基因携带情况存在显著性差异,显示出一定的相关性。vop Q和vop A/P基因在T3SS1阳性和T3SS2阳性菌株中分别表现出了不同程度的缺失。效应蛋白具有不同程度的缺失,部分提示了不同菌株在毒力上的差异。2.不同副溶血性弧菌混合培养下的数量变化利用荧光定量PCR技术,以tdh和trh为靶基因建立标准曲线,确定菌落数与C_T值之间的关系,以是否携带T6SS1基因为分类,测定不同副溶血性弧菌在混合培养后的数量变化,结果显示,在副溶血性弧菌中存在两种生存模式:(1)一株菌抑制另一株菌的生长,其中具有数量优势的菌株数量范围在9.31-9.58 log_(10) CFU/mL,劣势菌只有3.27-3.98 log_(10) CFU/mL,并且优势菌株均为T6SS1~+基因型菌株;(2)两株菌兼容共生,两株菌的数量范围在8.12-9.14 log10 CFU/mL之间。在混合培养条件下,部分T6SS1~+的副溶血性弧菌菌株存在明显的种内竞争优势,能够抑制其他菌株的生长。3.探究温度、培养时间、接种量对种内竞争的影响将混合后的副溶血性弧菌分别在30℃与37℃下进行培养,探究温度对种内竞争的影响,结果表明30℃时更有利于种内竞争作用。对混合培养4 h、8 h、12 h和24 h后的副溶血性弧菌进行数量检测,发现基本在培养8 h后,优势菌株与劣势菌的数量差异更大。并且比较了1:1和1:4接种量条件下混合培养后菌株的数量变化,结果发现在出现种内竞争的组别中,增加了劣势菌比例,混合培养后的菌株数量差异更大,这更加证实了造成混合培养下,数量差异的原因是由于细菌之间的相互作用而不是细菌的生长特性。实验结果表明,在相较于37℃的人体温度,温暖的海洋环境更利于种内竞争的发生,并且在对数生长后期种内竞争作用更明显,这表明种内竞争作用可能与环境适应性相关。4.混合培养前后对T6SS相关基因的表达有研究表明在许多革兰氏阴性菌中T6SS都是介导种内竞争的主要原因,而前文也证实了在副溶血性弧菌中确实存在种内竞争现象,我们通过RT-qPCR方法对混合培养前后T6SS相关基因表达量的分析对出现这种现象的原因进行初步的探索,基因表达分析结果显示,较单一培养的菌株,混合培养中副溶血性弧菌T6SS1和T6SS2相关基因的表达量均有明显的上调。导致这一现象的原因可能是,在混合培养的条件下,副溶血性弧菌可通过增强自身T6SS1和T6SS2相关基因的表达,以提升其在种内的竞争力,这为研究T6SS在副溶血性弧菌介导种内竞争的作用提供线索。
【图文】：

副溶血性弧菌,效应物

分泌系统的分泌机制可以分为一步分泌机制(One-step secretionmechanism)和两步分泌机制(Two-step secretion mechanism)。其中，Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型和Ⅵ型为一步分泌系统，而两步分泌系统则包括Ⅱ型、Ⅴ型、Ⅶ型、Ⅷ型和Ⅸ型五类分泌系统。在副溶血性弧菌分泌系统中只有 T3SS 和 T6SS 被研究，其他分泌系统均未见详细报道。副溶血性弧菌的 T3SS 和 T6SS 同属于双膜镶嵌分泌系统，其效应物通过一步分泌机制直接从细胞质被靶定至胞外或宿主细胞内，，进而导致宿主感染。2.3.1 副溶血性弧菌 T3SS 及调控机制T3SS 是一种多亚基的针状结构，用于将效应物直接递送到宿主细胞中，发挥毒力作用。研究发现 III 型分泌系统对于 TDH 和 TRH 协同致病过程中具有重要作用[15]。T3SS 存在于大多数革兰氏阴性菌中，副溶血性弧菌含有 2 套Ⅲ型分泌系统（T3SS），分别为 T3SS1（vp1656-1702）和 T3SS2（vpa1321-1731），后者可以细分为 T3SS2ɑ 和 T3SS2β，其效应物在致病力中的作用如图 1-1 所示。

抗菌作用,菌落,菌株,种内竞争

上海海洋大学硕士学位论文种内竞争[60]。而更多的研究显示在菌株中，尤其是海洋弧菌中，T6SS 具有众多抗菌 1-2 不仅介导种间竞争还参与种内竞争[61]。研究表明在费氏弧菌（eri, Vf）中，分为致死菌株和非致死菌株，非致死菌株可以共存，致死菌6SS2 接触依赖介导种内竞争；两种致死菌株的竞争结果包括：一株杀死相互兼容的稳定共存；或相互抑制共存[3]。霍乱弧菌（Vibriocholerae,V 个不同的 T6SS，霍乱弧菌利用 T6SS 可以特异性的抑制革兰氏阴性菌，杆菌、哈维弧菌、交替假单胞菌等，并且霍乱弧菌的 T6SS 具有杀死具有S 效应模块的菌株的作用[62]。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S941.42

【参考文献】