斑马鱼Ⅰ型干扰素和肿瘤坏死因子（TNFα）的表达和功能研究

发布时间：2020-05-11 20:00

【摘要】：鱼类干扰素(Interferon,IFN)是一种高效能、低分子量的可分泌蛋白,可诱导未受病毒感染的细胞进入抗病毒状态。大量研究证明,鱼类I型干扰素在保护鱼体免受病毒感染中发挥重要作用。但I型干扰素两个亚组在抗病毒作用方面存在时空差异,第一亚组可以快速诱导抗病毒反应但效果较弱,第二亚组诱导抗病毒反应延迟但高效。斑马鱼I型干扰素的第一亚组中存在两种基因:IFNφ1和IFNφ4。目前关于IFNφ1基因的研究较多,包括IFNφ1的表达以及其蛋白的功能等。相对IFNφ1,IFNφ4的研究较少,尤其是其功能方面的研究。目前,不少学者对IFNφ4是否可以保护鱼类免受病毒感染的相关研究结果还存在分歧。肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)作为重要的炎症因子,在抵抗细菌和病毒感染以及清除被感染的细胞等方面发挥着重要的作用。本研究对斑马鱼进行腹腔注射免疫刺激物、细菌和病毒病原,并采用荧光定量PCR技术分析IFNφ1和IFNφ4以及TNFα和TNFRSF1a在肾脏和脾脏中的表达。旨在分析当受到不同的病原刺激物感染时IFNφ1、IFNφ4、TNFα和TNFRSF1a在免疫器官(肾脏和脾脏)中的动态表达。同时以IFNφ1为对照,对IFNφ4生物学功能进行更深入研究。对斑马鱼进行腹腔注射免疫刺激物、细菌和病毒病原,并采用荧光定量PCR分析IFNφ1和IFNφ4在肾脏和脾脏中的表达水平。组织表达结果显示:IFNφ1和IFNφ4在斑马鱼肾脏、脾脏和心脏中表达量相对较高,在肝中表达量极低。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)和聚肌苷酸-聚胞苷酸(Polyinosinic acid-polycytidylic acid,PolyI:C)能够调控肾脏和脾脏中IFNφ1和IFNφ4基因的表达。不同细菌和病毒病原分别感染斑马鱼,结果1)嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,A.hydrophila)感染后IFNφ1转录本在脾脏(6 h和24 h)和肾脏(24 h)中显著升高;IFNφ4在脾脏和肾脏(6 h和48 h)表达水平也有显著上调;2)鲤春病毒血症病毒(Spring viraemia of carp virus,SVCV)感染时,IFNφ1表达量有显著升高;在整个感染过程中,IFNφ4表达仅在脾脏(7 d)和肾脏(3 d)有微量上调;3)E.tarda感染后,在肾脏和脾脏中IFNφ1和IFNφ4基因表达一直处于下调状态。实验结果表明,斑马鱼IFNφ1和IFNφ4基因在抵抗病毒和细菌感染过程中发挥重要作用,IFNφ4抗病毒作用弱于IFNφ1基因。为了进一步研究IFNφ4功能,本实验制备了IFNφ1和IFNφ4基因的多克隆抗体。以注射等体积PBS的斑马鱼为对照,对E.tarda和SVCV感染的斑马鱼肾脏、脾脏、鳃、肠四个组织进行免疫组化分析。实验结果表明鲤春病毒能够诱导斑马鱼IFNφ1和IFNφ4蛋白合成;E.tarda感染能抑制斑马鱼IFNφ1和IFNφ4蛋白合成。为了深入研究IFNφ1和IFNφ4参与的相关信号通路。通过原核表达制备IFNφ1和IFNφ4重组蛋白,分别用浓度为0.1 ng/mL、1 ng/mL、10 ng/mL、100 ng/mL、300 ng/mL的蛋白浓度孵育ZF4细胞(斑马鱼胚胎成纤维细胞)6 h,通过测定Mx基因转录水平,鉴定重组蛋白的活性和功能。实验结果表明不同浓度IFNφ1和IFNφ4重组蛋白均能显著上调Mx抗病毒基因表达水平。综合实际情况,选用20ng/mL IFNφ1和IFNφ4重组蛋白浓度孵育ZF4细胞6 h对mRNA和miRNA进行转录组分析。结果显示IFNφ1和IFNφ4蛋白共同上调966个mRNA基因和21个miRNA基因,共同下调548个mRNA基因和24个miRNA基因,共同上调和共同下调的信号通路上的基因十分相似,尤其是共同上调的信号通路上的基因。通过数据分析后选择抗病毒,干扰素通路,细胞凋亡,细胞因子等通路上的基因进行荧光定量验证。结果与转录组测定结果一致。E.tarda感染斑马鱼,荧光定量和疫组化实验都表明E.tarda降低斑马鱼IFNφ1和IFNφ4基因的表达。为了进一步验证E.tarda对IFNφ1和IFNφ4的作用,通过E.tarda感染ZF4细胞6 h和24 h,通过荧光定量和Western blot分别检测IFNφ1和IFNφ4基因的表达和蛋白合成情况。IFN实验结果表明E.tarda能够显著上调ZF4细胞中IFNφ1和IFNφ4基因表达。对斑马鱼腹腔注射免疫刺激物、细菌和病毒病原制备的样品,定量TNFα和TNFRSF1a转录水平,实验结果表明TNFα和TNFRSF1a在鱼类抵抗细菌和病毒感染过程中发挥重要作用。
【图文】：

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3.2 荧光定量（qRT-PCR）表达分析3.2 健康鱼 IFN 1 和 IFN 4 基因在不同组织中的表达取 30 尾健康斑马鱼，随机分成三组，每组 10 尾。解剖后分别取肝、肾脏、肠、皮肤、鳃、心、肝、脑、肌肉，置于 1 mL Trizol 溶液中，组织破碎仪破碎 2min，提取总 RNA，，制备 cDNA 荧光定量模板。qPCR 检测 IFN 1 和 IFN 4 基因的表达情况。实验结果显示 IFN 1 和 IFN 4 两种基因在脾脏、肌肉、肾脏和心脏中表达相对较高，在鳃、肝、肠中表达量较低。00 5 10log(copy)图 1-1 IFN 1、IFN 4 和 EF1α 基因标准曲线Fig. 1-1 Standard curves of IFN 1, IFN 4 and EF1α genes

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上海海洋大学硕士学位论文3 结果3.1 LPS 注射成年斑马鱼实验为了研究 LPS 对 IFN 1 和 IFN 4 基因表达的影响，本实验将每尾斑马鱼注射10 μL 100 μg/mL LPS 刺激物，在 12 h、24 h、48 h 和 72 h 时间点取脾脏和肾脏。提取总RNA、逆转录制备荧光定量模板、跑荧光定量PCR。数据处理同第一章2.7.2，用 graphpad prism 软件进行作图。结果显示 LPS 注射后脾脏 48 h 和 72 h IFN 1 和IFN 4 基因表达显著升高（图 2-1a）。肾脏在 72 h 表达显著上调（图 2-1b）。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

【参考文献】