大弹涂鱼排盐基因克隆及分子进化研究

发布时间：2020-05-12 04:19

【摘要】：大弹涂鱼(Boleophthalmus pectinirostris)属于虾虎鱼类,是暖水、广温、广盐性鱼类,生活于河口港湾潮间带淤泥滩涂及红树林区。其生境的特异性,潮间带盐度变化的剧烈性,对氨氮胁迫的耐受性及其可在空气中呼吸等独特的两栖适应性,吸引科学家对其生理生化和适应机制进行研究。本研究以大弹涂鱼为研究对象,对其Rhgp和Aquaporin基因家族进行克隆、功能分析、基因表达和分子进化研究,厘清这两类渗透压调节相关基因在鱼类及陆生动物间的相关性,阐述其进化选择,以期达到大弹涂鱼排盐基因进化分析的研究目的,从而有效解决海水、淡水、洄游性、广盐性等环境对排盐基因的选择压力分析。大弹涂鱼是一种两栖硬骨鱼,主要生活在潮间带,生境盐度变化剧烈,大弹涂鱼表现出对盐度和氨(铵)胁迫的耐受性。Rhgp基因家族在鱼鳃的NH_4~+转运中起重要作用,但他们对盐度响应的反应在这个物种中仍然不清楚。在本文研究中,从大弹涂鱼的鳃中克隆了四种Rhgp基因家族的基因Rhag,Rhbg,Rhcg1和Rhcg2。编码序列长度分别为1,308 bp,1,386 bp,1,458 bp和1,455 bp,编码435,461,485和484个氨基酸,Rhag,Rhcg1,Rhcg2和Rhbg分别含有11和12个跨膜结构域。低盐胁迫下Rhag的相对表达量显著降低,而高盐胁迫下Rhbg的相对表达量显著增加。在高盐胁迫或低盐胁迫下,Rhcg1的相对表达量降低但不显著,高盐胁迫下Rhcg2的表达量显著增加,然后下降。而在低盐胁迫下,Rhcg2的表达显著下降。这意味着这些Rhgp基因家族不仅是NH_4~+的转运蛋白,而且还参与了大弹涂鱼的盐度胁迫的耐受性。分子进化分析检测到鱼类中存在正选择位点,表明在鱼类向不同盐度环境的适应辐射中这四种基因可能发生着适应性进化。本研究对大弹涂鱼中水通道蛋白基因家族进行了全面概述,并为该基因家族的进化和盐度胁迫调控提供了新的见解。水通道蛋白基因家族已经在一些鱼类中被系统地表征,但在大弹涂鱼中还没有被识别及克隆。在本文研究中,16个水通道蛋白基因(BpAQP)在大弹涂鱼基因组中被鉴定出来。大弹涂鱼水通道蛋白基因家族的六个成员(BpAQP0,BpAQP1,BpAQP3,BpAQP4,BpAQP8和BpAQP9)在进化过程中经历了硬骨鱼特异性全基因组复制,现在每个基因在不同染色体上有两个多拷贝。基因表达谱分析表明,在9种不同组织(鳃,肠,皮肤,肝脏,脑,脾,肾,性腺(雌性)和肌肉)中检测到BpAQP基因的转录,并且发现每种BpAQP的基因表达模式不相同。此外,为了探索大弹涂鱼鳃中四种AQP基因(BpAQP1a,BpAQP1b,BpAQP3a和BpAQP3b)的时空分布规律,我们进行了大弹涂鱼盐度胁迫实验,将其从10‰海水(典型滩涂盐度)转移到高渗海水(30‰)或低渗淡水(0‰)中,然后观察四个基因的时空分布规律。通过相关功能基因家族鉴定、克隆和进化分析,不仅完善并补充了大弹涂鱼基因组学数据,而且在大弹涂鱼生理学,尤其是为分子进化生物学和分子遗传学等方面的实验开辟了道路,为后续对大弹涂鱼适应环境过程重要排盐基因筛选提供参考。并此,将丰富和加深对大弹涂鱼排盐基因在水生和陆生环境中功能和作用机理的理解,并将扩展对整个虾虎鱼类的排盐基因克隆及分子进化研究,其成果也预计在水生动物环境胁迫及基因选择进化研究等领域产生重大的影响。
【图文】：

大弹涂鱼,滑动窗口,编码序列,平均值

图 2.1 大弹涂鱼中所有已鉴定的 Rhgp 基因的滑动窗口图。Ka/Ks 值和每个 Rhgp 编码序列（bp）的位置分别显示在 y 轴和 x 轴上，窗口大小为 36 bp，步长为 6 bp。Fig 2.1 Sliding window plots of all the identified Rhgp genes in B. pectinirostris. The Ka/Ks value andthe position of each Rhgp coding sequence (bp) are shown on the y-axis and x-axis, respectively. Thewindow size is 36 bp, and the step size is 6 bp.2.2.9 统计分析统计分析由在 SPSS 软件下进行，使用单因素方差分析（ANOVA）测试平均值之间的差异，然后通过 Tukey 或 Dunnett T3 事后检验对平均值进行多重比较，这取决于Levene’s 对方差同质性的检验结果。P<0.05 的差异具有统计学意义，结果显示为平均值±标准偏差（S.D.）。2.3 结果2.3.1 Rhgp 基因的核苷酸、氨基酸序列及系统发育分析我们从大弹涂鱼的鳃中克隆了 Rhag，Rhbg，Rhcg1 和 Rhcg2 基因。他们的编码序列长度为 1,308 bp，1,386 bp，1,458 bp 和 1,455 bp，分别编码 435，461，485 和 484

序列,大弹涂鱼,基因家族

第二章大弹涂鱼 Rhgp 基因家族克隆及分子进化（G194，H200，F250 和 N251）和（G191，H197，F247 和 N248），NH4+对 NH3传导的去质子化（D176，S180，H184 和 H343），（D178，S182，H186 和 H345），（D192，S196，，H200 和 H359）和（D189，S193，H197 和 H356）的位点，但它缺乏像大肠杆菌 AmtB 中那样的潜在的 π 阳离子结合位点。此外，我们还预测出了两个或三个 N-糖基化位点。毫无疑问，这些序列比对预测显示了四个基因的序列高度保守性。
【学位授予单位】：浙江海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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