七鳃鳗RIG-I和MAVS的分子特征及其在抗病毒免疫中的信号通路

发布时间：2020-05-18 19:39

【摘要】：目前,水产动物的病毒性疾病给养殖业造成了巨大的经济损失,严重影响我国水产养殖业的可持续发展。先天性免疫是鱼类免疫系统的重要组成部分,是防御病毒入侵的第一道屏障,因而先天性免疫在水产动物的病毒防御中发挥着重要的作用,而至今为止并未有七鳃鳗感染病毒的报道,因此,深入研究七鳃鳗的抗病毒免疫防御机制对探索鱼类病毒防治的方法具有重要的现实意义。此外,七鳃鳗(Lampetra japonica)是最原始的脊椎动物之一,因此研究其先天性免疫对了解免疫系统的起源具有十分重要的意义。在先天性免疫系统中视黄酸(维甲酸)诱导基因蛋白I(retinoic acid-inducible gene-I,RIG-I)是识别双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)病毒核酸的主要模式受体之一,近年来,研究人员已经从多种低等脊椎动物中克隆并鉴定了RIG-I受体及相关基因,极大的推动了低等脊椎动物抗病毒免疫领域发展。本文对七鳃鳗的RIG-I样受体,相关基因及其抗病毒免疫信号通路进行了初步研究。首先,七鳃鳗不仅对dsRNA病毒模拟物poly(I:C)(polyinosinic-polycytidylic acid)刺激具有免疫应答反应,激活RIG-I样受体及其信号通路相关分子。通过高通量转录组测序技术对poly(I:C)刺激后的七鳃鳗进行了数据分析发现,数量最多的基因集中于蛋白翻译修饰和降解,通过KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)富集发现基因多集中在信号转导(signal transduction)、运输和分解代谢(transport and catabolism)和免疫系统(immune system)的信号通路上,说明七鳃鳗对于poly(I:C)的刺激产生了免疫应答;通过进一步数据分析从中筛选出poly(I:C)刺激相关信号通路的19个基因,主要覆盖于RIG-I样受体信号通路,其中白细胞介素8(interleutin-8,IL-8)和核因子抑制因子α(NF-kappa-B inhibitor alpha,NFKBIA)在不同组别的比较中表达量均上调;综合分析可得出,七鳃鳗不仅对dsRNA病毒刺激能够产生免疫应答,同时存在RIG-I样受体及其信号通路的相关分子,为后期七鳃鳗RIG-I受体及其抗病毒信号通路的研究奠定了基础。其次,七鳃鳗在受poly(I:C)和草鱼呼肠弧dsRNA病毒(Grass Carp Reovirus,GCRV)刺激能激活RIG-I/MAVS和TLR3/TRIF,启动核调控抗病毒免疫信号通路,从而产生IL-8和Mx效应分子以抑制病毒增殖。通过GCRV感染过表达RIG-I或线粒体抗病毒信号蛋白(Mitochondrial Antiviral Signaling Protein,MAVS)的草鱼卵巢细胞系(grass carp ovary cell line,CO),MTT法检测证明七鳃鳗的RIG-I和MAVS的过表达能够抵抗GCRV的感染;而且通过双荧光素酶报告系统检测,表明七鳃鳗的RIG-I或MAVS的过表达均能够使HEK293细胞中NF-κB和干扰素激活反应元件(interferon-sensitive responsive element,ISRE)表达上调,从而激活干扰素(interferon,IFN)抗病毒信号通路;通过poly(I:C)体外刺激(转染)七鳃鳗细胞和体内GCRV腹腔注射免疫,并用QPCR方法检测分析发现,无论是体外刺激还是体内刺激均激活七鳃鳗RIG-I/MAVS以及TLR3/TRIF依赖的核调控的抗病毒信号通路。同时,七鳃鳗抗病毒免疫信号通路的激活同时也能诱导细胞发生线粒体依赖的细胞凋亡,从而发挥抗病毒作用。通过在细胞中过表达七鳃鳗MAVS蛋白,激光共聚焦观察发现七鳃鳗MAVS定位于线粒体,同时高内涵检测发现伴随活性氧(reactive oxygen species,ROS)的产生;同时通过QPCR检测,与对照组相比,Bax表达量显著升高,Bcl-2表达量显著下降,且与免疫印迹检测结果一致,同时还发现伴随有细胞色素C(Cytochrome C,Cyt C)的释放,结果表明,七鳃鳗MAVS的过表达能激活细胞内线粒体依赖的细胞凋亡,从而达到抑制病毒增殖的目的。本文研究结果初步阐明了七鳃鳗在受到体内和体外刺激后不仅能激活RIG-I/MAVS和TLR3/TRIF启动核调控的抗病毒免疫信号通路,抑制病毒增殖,同时还可以激活细胞内线粒体依赖的细胞凋亡信号通路,从而发挥抗病毒作用;本研究有利于人们对脊椎动物抗病毒免疫进化的认识,为后期无颌类脊椎动物在该方面的研究提供了数据支持。
【图文】：

七鳃鳗RIG-I 和MAVS 的分子特征及其在抗病毒免疫中的信号通路 RLRs 含有与哺乳动物 RLRS相似的结构域。所有 RLRs 分旋酶结构域(DEXDc)、螺旋酶结构域(HELICc)、调节结构、RIG-I 和 MDA5 的 N 端区域有 2 个 caspase 激活和募集omain, CARD)，但 LGP2 中没有(图 1)，其中 CARD 在信号转AVS 通过 N 端 CARD 结构域与 RIG-I 相互作用，从而传递。

七鳃鳗RIG-I 和MAVS 的分子特征及其在抗病毒免疫中的信号通路(β-defensin)、hepcidin、NK-lysin、piscidin 和肝表达抗菌肽-2 (liver-obial peptide-2, LEAP-2)。表 1 第二代测序技术的特点及检测方法b. 1 Characteristics and detection methods of the second generation sequencing techno序技术 测序长度 具体步骤 特点术 300-800 个bp1、构建测序文库。片段两端锚定接头；2、乳液PCR扩增，固定于磁珠后PCR；3、焦磷酸测序。读长长，但是准确高。技术 100~200bp1、构建测序文库。两端加接头；2、桥式扩增，解链后固定于芯片进行PCR：3、测序。性价比最高、应用技术 几十个bp1、文库制备；2、乳液 PCR/磁珠富集。3、微珠沉积4、连接测序。最高的通量，测序正。
【学位授予单位】：辽宁师范大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2018
【分类号】：S941.41

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本文编号：2670218