拟穴青蟹骨形态发生蛋白BMP7在卵巢发育过程中的旁分泌作用研究

发布时间：2020-05-23 17:28

【摘要】：骨形态发生蛋白家族(BMP)在脊椎动物骨骼形成发育,细胞生长分化以及生殖等多种生理过程中起着重要的作用。BMP对生殖的作用主要是通过卵巢内部的BMP-SMADs信号通路来实现的。BMP家族配体在卵母细胞或滤泡细胞中合成,通过自分泌/旁分泌的作用方式与卵母细胞和滤泡细胞上的Ⅰ型和Ⅱ型跨膜受体(BMPRI和BMPRⅡ)结合成二聚体,随后磷酸化下游的SMADs,SMADs进一步调控目的基因的表达,从而调控卵巢发育和成熟。然而,在无脊椎动物中,BMP家族的功能研究,尤其是生殖作用的研究很少,目前尚不清楚BMP家族在无脊椎动物卵巢中是否也存在类似脊椎动物的自分泌/旁分泌机制。本文以我国东南沿海重要的经济蟹类——拟穴青蟹(Scylla paramamosain)为研究对象,通过RACE等分子克隆技术从拟穴青蟹中克隆得到了配体BMP7、受体BMPRIB和BMPRⅡ的cDNA全长序列,并通过BLAST比对等方法对其核酸和氨基酸序列进行了初步分析;应用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、原位杂交、RNA干扰等技术探究了 BMP家族基因对卵巢发育的影响。此外,针对BMP家族一个重要的配体BMP7,采用卵母细胞和滤泡细胞分离、细胞离体培养和RNA干扰等技术研究了其对卵巢成熟的作用及其机制。主要的研究成果如下:1)BMP7及其受体在卵巢发育过程中的功能。从拟穴青蟹中克隆得到BMP7基因全长1279 bp,开放阅读框为909 bp,编码302个氨基酸;BMPRIB基因全长2388 bp,开放阅读框为1557 bp,编码518个氨基酸;BMPRⅡ基因全长2762 bp,开放阅读框为1875 bp,编码624个氨基酸。实时荧光定量PCR表明BMP7、BMPRIB和BMPRⅡ在拟穴青蟹各组织中广泛分布,尤其是卵巢。配体BMP7在卵黄发生前期表达较高,随着卵巢发育迅速降低,而受体BMPRs随着卵巢发育表达量不断升高。原位杂交结果显示BMP7 mRNA定位在滤泡细胞中,而受体BMPRs mRNA则定位在卵母细胞和滤泡细胞中。RNA干扰实验表明,BMPRs的双链RNA(dsRNA)能够显著抑制体外培养卵巢组织中SpSmad 1和SpVgR基因的表达。这些结果表明,BMP7和BMPRs可能以自分泌/旁分泌的方式参与调节了卵巢发育。2)BMP7对卵母细胞成熟的影响及其作用机制。采用机械分离的方法,从处于成熟期的卵巢中分离得到滤泡细胞和卵母细胞(裸卵)。半定量PCR的结果再次验证了 BMP7、BMPRIB和BMPRⅡ的定位,BMP7主要在滤泡细胞中表达,而BMPRIB和BMPRⅡ在卵母细胞和滤泡细胞中均有表达。体外培养实验显示,在17a,20β-双羟孕酮的诱导下,青蟹Cyclin B的基因和蛋白表达量均有升高而SpBMP7基因表达量下降。当去除卵母细胞与滤泡细胞之间的间隙连接时,SpBMP7对卵母细胞成熟的抑制作用并不会受影响。这些结果表明,BMP7可能以旁分泌的作用方式抑制卵巢成熟,起到避免卵巢过度成熟的作用。综上所述,拟穴青蟹BMP家族以自分泌/旁分泌的作用方式来调节卵巢发育和成熟,其中BMP7可能对卵巢成熟起到抑制作用。本结果也为甲壳类卵巢发育的研究提供了新的思路。
【图文】：

胞和颗粒细胞合成分泌，而受体在卵母细胞和膜细胞、颗粒细胞中均有表达［９，逡逑２９＿３２ＬＴＧＦ－ｐ家族成员的这种特异性表达通过自分泌／旁分泌作用在卵巢内部各细逡逑胞间形成了一个复杂的相互调控的网络，从而调节卵巢的发育和成熟［６］（图１－１）。逡逑４逡逑

进行相对表达量分析，运用ＳＰＳＳ邋１７．０软件分析ｅｖｅｎｅ’ｓ检验检测数据的方差同质性。采用单因验来确定Ｐ值。当Ｐ＜０．０５为差异显著。逡逑取逡逑成功提取了比较完整的青蟹卵巢总ＲＮＡ，电泳结到２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ的ｒＲＮＡ，，条带清晰且较锋利，降解，ｍＲＮＡ弥散分布，可用于后续ｃＤＮＡ的合
【学位授予单位】：厦门大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S917.4

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本文编号：2677706