广西凡纳滨对虾源副溶血弧菌毒力基因检测及tlh基因的克隆与表达

发布时间：2020-05-23 16:33

【摘要】：副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus, VP)是我国沿海水产养殖的重要病原菌之一,广泛存在于海水和海产品中,因致病性副溶血弧菌暴发性增殖引发的水生动物疾病每年都会给水产养殖业带来巨大的经济损失。在我国,由副溶血弧菌污染引起的微生物食源性疾病居首位,广西位于我国南部地区,海产品消费量大,人们喜欢食用生的或者半生熟的海产品,因此副溶血弧菌是引起广西地区食物中毒最主要的病原菌。耐热直接溶血毒素(Thermostable direct hemolyticus,TDH)、相对耐热直接溶血素(TDH-related hemolysin,TRH)和不耐热溶血素(Themolabile hemolysion,TLH)是副溶血弧菌的主要毒力因子,能产生多种溶血素,分别由tdh、trh和tlh基因编码。本研究分别从广西沿海的钦州、北海和防城港3市采集160份凡纳滨对虾病样,进行副溶血弧菌的分离、鉴定以及药物敏感性试验,用PCR方法对tdh, trh和tlh毒力基因进行检测,并成功表达了tlh毒力基因,为蛋白纯化、抗体制备及蛋白性质研究等领域打下基础,也为副溶血弧菌感染的监控和防治提供技术支撑。获得的主要结果有：1.通过常规方法进行细菌分离,运用API细菌鉴定系统和16SrRNA基因序列分析对细菌进行生化鉴定和分子鉴定。从160份样本中共检出副溶血弧菌67株,检出率为41.88%；利用Blast分析了67株分离菌株的16S rRNA基因序列,与GenBank中已经登录副溶血弧菌相应序列的同源性进行比对,结果显示,67株分离菌株之间高度同源,相似性99.2%～100%,67株分离菌株与副溶血弧菌标准菌株ATCC 17802 (NR 114632.1)的亲缘关系最近,相似性98.8%～100%。药物敏感性试验结果表明,67株副溶血弧菌对复达欣、菌必治、复方新诺明、舒普深、氟哌酸、恩诺沙星、环丙沙星、左氟沙星、依诺沙星、氧氟沙星、特治星和氟苯尼考12种药物的敏感率在80%以上,青霉素G、氨苄青霉素、磺胺二甲嘧啶、盐酸沙拉沙星和磺胺-6-甲氧嘧啶5种抗生素对67株副溶血弧菌的抑菌能力非常弱,表现出很强的耐药性。2.应用PCR方法对67株副溶血弧菌进行tdh、trh和tlh毒力基因检测,检测结果,67株副溶血弧菌的tdh和trh毒力基因均为阴性,tlh毒力基因均为阳性。3.将扩增得到的tlh基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pET-28a上,构建重组表达载体pET-28a然后转入到大肠杆菌BL21感受态细胞中,经IPTG诱导,SDS-PAGE电泳证明tlh外源基因发生了融合表达,表达产物与推测的理论产物大小61KDa相符。经Western blotting鉴定TLH融合蛋白能与Anti-6×His tag抗体发生特异反应,说明TLH溶血毒素在大肠杆菌原核表达系统中准确表达。
【学位授予单位】：广西大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S945.49

【参考文献】

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本文编号：2677641