拟穴青蟹HIF-1对三种糖代谢酶表达和病毒繁殖的影响及c-型溶菌酶的功能分析

发布时间：2020-05-23 15:27

【摘要】：拟穴青蟹(Scylla paramamosain)是我国东南沿海城市具有较高经济价值的养殖品种。但随着养殖规模和养殖密度的增加,病害问题日益严重,成为阻碍产业发展的一个重要瓶颈,而水中溶解氧的缺乏是造成疾病发生的重要原因之一。病毒是导致拟穴青蟹发病的一类重要病原,而其在宿主体内的繁殖需要宿主提供能量和物质,为了解低氧环境下病毒病容易爆发的机制,本文研究了低氧诱导因子-1(Hypoxia-inducible factor-1,HIF-1)对拟穴青蟹糖代谢途径中乳酸脱氢酶(SpLDH)、磷酸果糖激酶(SpPFK)和果糖-1,6-二磷酸激酶(SpFBP)的调控作用以及对青蟹体内病毒繁殖的影响;另外,还克隆了拟穴青蟹c-型溶菌酶(SplyzC)全长,研究了其组织分布和生物学功能。具体研究成果如下:(1)克隆了拟穴青蟹SpLDH、SpPFK和SpFBP cDNA基因全长,序列分析结果显示:SpLDH cDNA序列全长1453 bp,开放阅读框包含996 bp核苷酸,编码332个氨基酸,蛋白理论分子量36 kDa,理论等电点为7.63,序列比对发现与夏威夷红虾(Halocaridina rubra)LDH相似性最高,为89%;SpPFK基因cDNA序列全长为3634 bp,开放阅读框包含2859 bp核苷酸,编码953个氨基酸,蛋白理论分子量105.66 kDa,理论等电点5.76,序列比对发现与克氏螯虾(Procambarus clarkii)PFK相似性最高,为83%;SpFBP基因cDNA序列全长1445bp,开放阅读框包含1005 bp核苷酸,编码335个氨基酸,蛋白理论分子量36.17kDa,理论等电点6.45,序列比对分析发现与中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)FBP相似性最高,为92%。实时荧光定量PCR分析发现SpLDH、SpPFK和SpFBP在拟穴青蟹各个组织中均有表达,其中:SpLDH在血细胞中表达量最高,鳃和心脏次之,黏膜中表达量最低;SpPFK在鳃中表达量最高,血细胞和肌肉中次之,黏膜中最少;SpFBP在肝胰腺中表达量最高,心脏和胃中次之,肌肉中最少。注射dsRNA-HIF-1α(简称dsHIF-1α)后被检测组织中的SpLDH、SpPFK和SpFBP表达均显著下调。在低氧状态下:SpLDH表达量在鳃中最高,其次是心脏和血细胞,肠和黏膜中最低;SpPFK在鳃和心脏中表达量较高,血细胞肌肉和胃中次之;SpFBP在肝胰腺、心脏和黏膜中表达量较高,鳃、胃和肠中次之。常氧和低氧状态下,SpLDH和SpPFK在检测组织中表达量均上调,SpFBP除了在血细胞中表达量下调外在其余检测组织中也都表现为上调。干扰HIF-1α的表达后,在低氧环境下SpLDH、SpPFK和SpFBP表达以及LDH活性和乳酸堆积量同有氧环境相比没有发生显著变化。感染青蟹双顺反子病毒(Mud Crab Dicistrovirus-1,MCDV-1)后,SpLDH、SpPFK和SpFBP表达都不同程度上调。干扰HIF-1α的表达后,人工感染MCDV-1,拟穴青蟹SpLDH、SpPFK和SpFBP表达量和LDH活性相对于直接人工感染病毒变化降低,葡萄糖和乳酸含量也会降低且病毒拷贝数和死亡率都会大幅度下降。(2)拟穴青蟹SplyzC基因全长849 bp,开放阅读框包含669 bp核苷酸,编码223个氨基酸的蛋白,蛋白理论分子量为23.7 kDa,理论等电点为8.90。序列比对结果显示SpLyzC与来自其他甲壳动物的c-型溶菌酶相似性仅为23%-68%,但溶菌酶活性位点高度保守;SplyzC可以在所有检测组织中检测到,在肝胰腺组织中表达水平最高。副溶血性弧菌(Vibrio parahaemolyticus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)和MCDV-1感染都可导致拟穴青蟹肝胰腺和鳃组织中SplyzC表达上调。重组蛋白rSpLyzC在体外对溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)、金黄色葡萄球菌、哈维弧菌(Vibrio harveyi)和副溶血弧菌均具有抗菌活性。注射SpLyzC的双链RNA干扰SpLyzC表达后人工感染副溶血性弧菌,拟穴青蟹血淋巴中细菌的浓度和拟穴青蟹的死亡率均升高;干扰SpLyzC表达后感染MCDV-1,拟穴青蟹被检测组织中病毒拷贝数和死亡率均升高。综上所述,低氧胁迫和MCDV-1感染可引起SpLDH、SpPFK和SpFBP的表达上调,HIF-1可以调控SpLDH、SpPFK和SpFBP的表达及MCDV-1在拟穴青蟹体内的繁殖,从而降低该病毒感染导致的死亡;SpLyzC可在拟穴青蟹多个组织中表达,具有广谱的抗菌活性,对病毒的侵染也有一定的抵抗作用。
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上海海洋大学硕士学位论文代谢研究进展糖代谢的分类代谢一般指葡萄糖和糖原等在体内的一系列复杂的化学反应[49]，机体内途径主要有葡萄糖的无氧酵解、有氧氧化和糖异生等代谢途径[50]。糖代谢的调控和应用0 世纪 20 年代，Heinrich Warburg 首次注意到癌症细胞的糖酵解程度异常

上海海洋大学硕士学位论文因此他认为改变葡萄糖代谢是癌细胞在异常条件下维持生存的关键因素象后来称为 Warburg 效应（图 1-1）[51]。对于三羧酸循环，糖酵解产能效率低，但它能为肿瘤细胞快速提供 ATP供许多大分子物质，满足肿瘤细胞对于能量和代谢底物的需求[52]，且糖的大量乳酸为肿瘤细胞提供了一个酸性环境，满足肿瘤细胞对环境的要瘤细胞通过有氧糖酵解代谢为其自身代谢提供需要的营养物质，因此研调控可以为靶向能量代谢治疗肿瘤提供参考[54]。葡萄糖是分布最广、在直接参与新陈代谢且维持生命活动最不可缺少的一种单糖[55]，葡萄糖进，通过糖酵解和有氧氧化等过程产生能量，供给肿瘤细胞的生长增殖[56是糖酵解途径的终产物，在缺氧条件下，，可被乳酸脱氢酶 LDH 催化成乳前已发现的 LDH 抑制剂均有一定的抗肿瘤效应，抑制 LDH 活
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S945

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本文编号：2677555