半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3基因的克隆与表达分析

发布时间：2020-05-23 23:10

【摘要】：半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)是我国重要的经济海水鱼类,具有生长迅速、体积大、口味鲜美、营养成分丰富等优良性状,成为近年来一种优良的养殖对象。但随着养殖规模的扩大,各种传染性疾病日益频繁地发生,尤其是以哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)感染为主的细菌病,发病快,传播迅速,给养殖产业带来巨大冲击。目前,多数养殖户在养殖过程中只能采用抗生素和化学药品来防控和治疗此类病害,不仅收效甚微,而且还会增加病原菌的抗药性,严重污染水体环境,因此,从提高鱼类本身的抗病能力出发,对于半滑舌鳎免疫抗病分子机制的研究逐渐受到重视。本文运用分子生物学方法及基因工程技术,以半滑舌鳎中两个免疫相关基因TGF-β1和TGF-β3为研究对象,开展了基因的性质与功能的研究。探索了二者对半滑舌鳎免疫调节机制的影响规律,对于探索半滑舌鳎抗病分子机制以及抗病育种具有重要的理论意义;半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3蛋白的重组表达研究对于开发用于半滑舌鳎疾病防治的基因工程制剂等方面具有重要的应用价值。首先,本研究从半滑舌鳎肝脏中克隆获得了TGF-β1基因。推导的TGF-β1氨基酸序列含有6个N端糖基化位点,一个整合素与其配体蛋白识别位点和一个TGF-β家族标签。系统进化树分析显示,半滑舌鳎TGF-β1分别与斜带石斑鱼(Epinephelus coioides)和海鲷(Sparus aurata)的TGF-β1亲缘关系较为密切。实时荧光定量PCR结果表明,半滑舌鳎TGF-β1基因在健康鱼的多个组织(心脏、肾脏、肠、肌肉、皮肤、脑、鳃、肝脏、脾脏)中均有表达,在皮肤中表达量最高,其次是肾脏,在肌肉中表达量最低。经哈维氏弧菌感染后,TGF-β1在肝脏、脾脏和肾脏中呈现先上升后下降的表达趋势,在感染48h后的肝脏中表达量达到最大值,是对照0h组的3.17倍;在鳃中,TGF-β1表达量相对于对照0h组没有显著变化。同样地,从半滑舌鳎肝脏中克隆获得了TGF-β3基因。推导的TGF-β3氨基酸序列均含有3个N端糖基化位点和一个TGF-β家族标签。系统进化树分析显示,半滑舌鳎TGF-β3分别与与红鳍东方渶(Takifugu rubripes)和罗非鱼(Oreochromis niloticus)的TGF-β3亲缘关系较为密切。qRT-PCR结果表明,半滑舌鳎TGF-β3基因在健康鱼的多个组织(心脏、肾脏、肠、肌肉、皮肤、脑、鳃、肝脏、脾脏)中也存在差异性表达,在皮肤中表达量最高,其次是脑,在肌肉中表达量最低。经哈维氏弧菌感染后,TGF-β3在脾脏、肾脏和鳃中呈现先上升后下降的表达趋势,在感染24h后的鳃中表达量达到最大值,是对照0h组的4.71倍;在肝脏中,TGF-β3表达量相对于对照0h组没有显著变化。以上结果提示,TGF-β1和TGF-β3可能在半滑舌鳎抵御细菌感染的免疫中发挥了重要作用,并且在抗菌免疫过程中这二者之间可能存在复杂的相互作用机制。本研究为证明二者参与机体免疫调节提供了证据,为半滑舌鳎分子免疫研究提供了理论依据。其次,利用PCR方法克隆获得了带有AvrII和NotI酶切位点的半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3基因,并将其插入分泌型表达载体pPIC9K中,成功构建出重组表达载体。将质粒线性化后电击转入毕赤酵母GS115菌株,GS115菌落PCR和测序验证表明半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3已整合到毕赤酵母染色体上。经G418抗性多拷贝筛选,获得了可以在4mg/mL的G418抗性水平正常生长的多拷贝重组酵母菌株。添加甲醇对重组酵母菌株进行诱导表达,诱导表达的蛋白提取物通过SDS-PAGE和Western-Blot检测分析,与空载体质粒相比,TGF-β1和TGF-β3重组表达质粒在标准Marker的45kD附近出现明显蛋白条带,与预期大小基本一致,表明半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3在毕赤酵母中得到正确表达。本研究实现了半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3基因在体外的重组表达,而且酵母表达的重组蛋白能够直接分泌到培养基中,便于后期的纯化以及大量制备。为进一步研究半滑舌鳎TGF-β1和TGF-β3基因的功能提供了资料,并为高效、简便地生产可以提高半滑舌鳎免疫力和组织损伤修复能力的饲料添加剂奠定了基础。
【图文】：

上海海洋大学硕士学位论文化的 II 型受体结合形成异源四聚复合物，I 型受体能识别并结合这个异源四聚复合物。自动磷酸化的 II 型受体胞内区的蛋白激酶结构域会转磷酸化，将磷酸传递到 I 型受体胞内区 GS 结构域中，将其丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化，从而激活 I 型受体[71、72]。SARA 蛋白协助召集游离的 R-Smad 向受体聚集，并协助 R-Smad 锚定在受体上[73]。经活化的 I 型受体通过其 GS 区与 R-Smad C 端保守域 MH2 结合，，并将R-Smad C 端 SSXS 结构域中的两个 Ser 残基磷酸化[74]。R-Smad 改变构象，与 I 型受 体 分 离 。 Co-Smad 能 识 别 R-Smad 磷 酸 化 的 MH2 结 构 域 ， 并 与 之 形 成R-Smad-Co-Smad 异源多聚复合物，将信号进一步传递到核内[75]。

24图 2-1 半滑舌鳎 TGF-β1 与其它物种 TGF-β1 氨基酸序列比对Figure 2-1 Comparison of deduced amino acid sequences of TGF-β1 from half smooth tongue soleand other species注：“—”表示 N 糖基化位点，“...”表示整合素结合位点（RGD），“ ”表示 TGF-β家族标签。黑色区域表示不同物种 TGF-β1 完全相同的氨基酸残基，深灰色区域表示不同物种TGF-β1比较保守的氨基酸残基，浅灰色区域表示不同物种TGF-β1保守性较弱的氨基酸残基，“.”表示不同物种 TGF-β1 缺失的氨基酸残基。Note:“—”denotes N-glycosylation site, “...”denotes integrin binding site, “ ”denotes TGF-β familysignature. Black regions indicate the 100% conserved amino acid residues of TGF-β1 in differentspecies, Dark grey regions indicate the high conserved amino acid residues of TGF-β1 in differentspecies, Light grey regions indicate the low conserved amino acid residues of TGF-β1 in differentspecies, “.”indicates the lack of amino acid residues of TGF-β1 in different species.
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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本文编号：2678090