淇河鲫GPx1和GPx4基因的克隆及其对嗜水气单胞菌的响应

发布时间：2020-05-26 01:56

【摘要】：谷胱甘肽过氧化物酶是细胞中抗氧化系统的组成部分,主要功能是排除细胞内过多的氧自由基,从而保护生物体遗传物质的完整性、细胞膜的稳定性等。水中动物因缺少特异性的免疫,故其自身的天然免疫就尤为重要。最近一些年,很多实验已论证GPx参与水中生物抗氧化的过程。淇河鲫(Qihe crucian carp Carassius auratus)作为河南省独有珍稀水商品,具有十分显著的营养价值和经济价值,所以探究淇河鲫GPx基因结构特点及对病原菌的免疫响应有助于我们理解GPx的生物学功能。本论文用淇河鲫做为研究的材料,提取淇河的鲫鱼肝脏总RNA,运用RT-PCR技术扩增出GPx1和GPx4 cDNA的完整序列;利用qPCR技术分批检测了GPx1在正常淇河鲫9种器官组织中的表达状况及用嗜水气单胞菌处理后其在肝、鳃、肾、脾和头肾中的表达变化。实验结果能帮助我们理解淇河鲫的抗氧化保护机理,同时给淇河鲫鱼病防控提供理论基础。根据已经知道的序列,合成相应的PCR引物,同时克隆出淇河鲫GPx1和GPx4中间保守的序列、3'-UTC和5'-UTC,通过拼接后分别得到889 bp和875 bp两段cDNA完整序列。淇河鲫GPx1的开放阅读框(Open reading frame,ORF)为576 bp,翻译191个氨基酸。预测淇河鲫GPx1的相对分子质量是21.61KD,理论等电点为6.84。在酶催化中心里,Se结合位点是第158~160位密码子编码的半胱氨酸。两个家族标签序列:65LGAPCNQF72、153WNFEKF158。淇河鲫GPx1无跨膜区与信号肽,是一种胞内酶。淇河鲫GPx4的ORF共513 bp,翻译170个氨基酸。预测其分子质量为19.31KD,理论等电点为7.64。活性中心的Se结合位点是第208~210位密码子编码的半胱氨酸。GPx4家族标签序列:71LGFPCNQF78、136WNFTKF141。同时将两个基因的氨基酸全长顺序放在NCBI中进行BLAST比对,发现它们在不同物种中都有很强的保守性。运用qPCR技术检查淇河鲫鱼9种器官组织(肝、心、肌肉、脾、肠、头肾、卵巢、肾和鳃)中GPx1的mRNA表达特征。实验结果表明GPx1在各内脏和组织中都有表达,且其表达的大小存在差异。其中,肝中表达量最大,在鳃、头肾、肾脏、心脏、肠、脾脏、卵巢和肌肉中的表达的量逐渐的减少。同时采用qPCR技术检查了淇河的鲫胚胎发生各个阶段的GPx1 mRNA表现情况,结果显示,从受精到胚胎发育再到孵化破膜,GPx1 mRNA表达量逐渐升高。利用嗜水气单胞菌对淇河鲫鱼实施侵染实验,采用qPCR技术检测肝、鳃、肾、脾、头肾中GPx1的mRNA在0 h、3 h、6 h、12 h、24 h及48 h六个时间点的表达变化。结果表明,经嗜水气单胞菌侵染后,GPx1在各器官组织中的表达都呈现极显著变化(p0.01**),其变化趋势为:表达量先上调,然后下降,在头肾中还出现了再次上升的现象,而且都是在6 h达到最大表达量。但是在鳃中的GPx1 mRNA表达量处理组与对照组表达变化不显著。这显示淇河鲫GPx1可能在抗病原菌侵染的免疫反应中发挥着十分重要的功能。结论:1.扩增得到淇河鲫GPx1和GPx4 cDNA完整序列。淇河鲫GPx1 cDNA完整序列有889 bp能翻译191个氨基酸;淇河鲫GPx4 cDNA完整序列有875 bp,能翻译170个氨基酸。2.经嗜水气单胞菌侵染后,淇河鲫GPx1在肾、脾、头肾和肝中的表现与对照组相比均有极其显著性差异(p0.01**),这表明淇河鲫GPx1可能在淇河鲫抵抗病原菌感染的免疫过程中起着重要作用。3.胚胎发育阶段的GPx1 mRNA表达逐渐升高,表明在淇河鲫胚胎发育阶段和幼体发育阶段,GPx1在鱼体抗氧化和提高幼体存活率方面起重要作用。
【图文】：

罗氏沼虾GPx催化中心的Sec[23]

算 mRNA 所处的外界条件很适合翻译，其表达序列对于真核生物 GPx 正常表达翻译是不可或在真核生物翻译过程中形成的茎环结构有两种，， Form 1 型目前发现的有凡纳滨对虾（Litopenae于 Form 2 型目前发现的有罗氏沼虾硒代半胱氨有几个序列会是高度保守的如图中加粗的几个碱图 1-1 罗氏沼虾 GPx 催化中心的 Sec[23]
【学位授予单位】：河南师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943;S917.4

【参考文献】

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6 孟宇竹;雷昌贵;王霞;马勇;张德广;;SOD抗氧化作用及其在食品工业中的应用[J];中国食品添加剂;2009年01期

7 赵宏亮;肖调义;;淇河鲫鱼资源现状及保护对策[J];河南水产;2007年03期

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9 韦雪芳;王冬梅;刘思;周鹏;;信号肽及其在蛋白质表达中的应用[J];生物技术通报;2006年06期

10 盛良全,郑晓云,童红武,刘少民,刘清亮;Cu~(2+)和铜锌超氧化物歧化酶作用的光谱学研究[J];化学学报;2005年18期

本文编号：2681093