转NNVCP基因衣藻预防石斑鱼病毒性神经坏死病

发布时间：2020-05-26 01:49

【摘要】：石斑鱼是一种含有高蛋白、低脂肪的上等食用鱼,是我国人工养殖的重要经济鱼类。其中,石斑鱼的主要养殖品种是珍珠龙胆石斑鱼。珍珠龙胆石斑鱼常因感染鱼类病毒性神经坏死病(viral nervous necrosis,VNN)而损失惨重。VNN是养殖鱼类的常发病,其危害大,死亡率高达65-100%。隶属于罗达病毒科(Nodaviridae),目前认为其有四种基因型。通过病毒血清型研究表明,4种基因型外壳蛋白的254～256位氨基酸为主要抗原决定簇,说明外壳蛋白基因可以用作抗原基因。目前,由于没有特效疫苗和特异药物防治石斑鱼病毒性神经坏死病,所以石斑鱼苗养殖受到VNN的严重制约。而微藻能进行光合作用,是最原始的初级生产者成员,也在水产养殖中有巨大作用,特别在水产动物的小苗阶段。衣藻(Chlamydomonas)生长周期短、是水体中常见优势藻类,适生性强,是幼鱼的天然饵料。而外壳蛋白含抗原决定簇,可以作为抗原在饵料微藻中表达,得到抗原蛋白,使得饲喂了转病毒性神经坏死病病毒外壳蛋白(NNVCP)基因衣藻的石斑鱼持续获得抗原免疫。因此,采用转NNVCP基因衣藻来预防VNN具有广阔的应用前景。本论文从以下方面进行研究:经济藻株的保种、分离纯化和扩培;构建pCAMBIA1302-NNVCP重组载体;将重组载体采用玻璃珠转化法转入莱茵衣藻;并进行不同种类,不同浓度的抗性筛选;随后对筛选的藻株进行DNA、RNA水平验证;收集海南省乐东县某石斑鱼养殖基地培育的珍珠龙胆石斑鱼发病鱼苗,对其初步确诊断为VNN;采用转基因微藻混合饲料进行预防石斑鱼VNN实验,其研究结果如下:1、经济藻株的保种、分离、纯化和扩培对六种经济藻株的液态不纯藻株采用稀释分离法进行分离,成功分离纯化出六种经济藻株液态纯种;采用10、20、40、60、80、100 μg/ml浓度的氨苄青霉素,对其采用平板划线法,成功在固体培养基上纯化出盐藻、海水小球藻、扁藻。并将纯化的藻种分别用对应的培养基进行保种。采用逐步放大培养法,对3种经济藻株进行液态扩培,每次扩培终体积为100 L,期间总共扩培5次,总共扩培经济藻株体积500L。本实验不仅增加了实验室藻株资源库的种类,扩培的藻株用于苗种企业生产实践,实现了产研学的价值。2、重组载体的构建、转化衣藻及筛选通过NCBI查找NNVCP基因与pCAMBIA1302载体重组,成功构建表达载体pCAMBIA1302-NNVCP。并将pCAMBIA1302-NNVCP真核表达载体转入衣藻。对pCAMBIA1302-NNVCP转基因藻株进行抗性筛选。结果显示:pCAMBIA1302-NNVCP转基因藻株分别通过含有潮霉素2、5、10、15 μg/ml TAP固体培养基进行筛选,筛选成功的藻株有42株,最终接种在含有10μg/ml潮霉素的固体TAP培养基。3、转基因藻株的鉴定、保种、扩培和采收对抗性筛选后的转基因藻株进行鉴定,对其进行DNA、RNA提取,并进行PCR验证。结果显示:在pCAMBIA1302-NNVCP藻株中,有26株呈阳性。将得到的26株转基因藻株保种在含有对应抗生素的平板培养基,并进行转基因藻液态扩培,扩培出pCAMBIA1302-NNVCP-14/15/16藻液质量分别为60.2g、66.7g、69.2g、65.7g,为转基因微藻预防石斑鱼VNN提供实验材料。4、海南珍珠龙胆石斑鱼苗VNN的初步诊断收集海南省乐东县某石斑鱼养殖基地培育的珍珠龙胆石斑鱼发病鱼苗。通过诊断,结果显示:出现了典型VNN症状,对患病鱼体进行了寄生虫学检查,结果为阴性;采用RT-PCR方法、采用OIE推荐引物,VNN的PCR产物特异性片段大小为421 bp;采用细胞肿大病毒、虹彩病毒检测引物,采用RT-PCR方法排除混合感染,以此初步诊断为VNN。在此之前,很少有报道VNN在冬季发生,因此本研究对深入探索VNN具有重要意义,并且为攻毒实验提供材料。5、转基因微藻预防珍珠龙胆石斑鱼VNN实验探究出两种简易自制转基因工程微藻混合饲料的制作方法。连续十天喂食转基因混合饲料后,进行攻毒实验。从分子水平、细胞学水平、生物学水平结果显示:攻毒24小时后实验组脑组织中VNN病毒外壳蛋白mRNA含量比饲料对照组分别下降了67.25%、36.61%、77.17%;攻毒24小时实验组脑组织空泡化数量比对照组少,空泡化病变比对照组轻微;实验组平均存活率比饲料对照组高出33.33%,表明转NNVCP基因衣藻对预防石斑鱼病毒性神经坏死病有一定的作用。
【图文】：

过程图,牟氏角毛藻,扩繁,扩培

盐藻扁藻逡逑叫：逡逑图２－２纯化的杜氏盐藻、亚心型扁藻、海水小球藻逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－２邋Ｐｕｒｉｆｉｅｄ邋ｓａｌｔ邋ａｌｇａｅ，邋ｐｉａｔｙｍｏｎａｓ邋ｓｕｂｃｏｒｄｉｆｏｒｍｉｓ，邋ｍａｒｉｎｅ邋ｃｈｌｏｒｅｌｌａ逡逑采用逐步放大培养法，对海水小球藻、卵囊藻、牟氏角毛藻、微拟球藻进行液态逡逑扩培，每次扩培终体积为１００邋Ｌ，期间总共扩培５次，总共扩培经济藻株体积５００邋Ｌ，逡逑得出牟氏角毛藻、海水小球藻、卵囊藻、微拟球藻四种藻种的开放式扩培是可行的，，逡逑培养过程中应该逐渐进行开放，并且转接比例不宜过大（丨：５－１：１０）。不仅增加了实逡逑验室藻株资源库的种类，扩培的藻株用于苗种企业生产实践，实现了产研学的价值。逡逑角毛藻扩繁过程逦一￣７逡逑ｔｉｌ邋１逦．邋一邋—逡逑■邋—－灥一邋＾

牟氏角毛藻,扩繁,杜氏盐藻,扁藻

逦１０ＵＳＨ光照逦Ｉ邋＾逡逑Ｂ逦■}0逡逑图２－３牟氏角毛藻的扩繁过程逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－３邋Ｔｈｅ邋ｐｒｏｃｅｓｓ邋ｏｆ邋ｅｘｐａｎｓｉｏｎ邋ｏｆ邋Ｃｈａｃｔｏｃｃｒｏｓ逡逑１３逡逑
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S943

【参考文献】