半滑舌鳎食欲素的克隆与体外重组表达研究

发布时间：2020-05-26 13:14

【摘要】：本文以半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)为研究对象,采用解剖学、组织切片、电镜观察和两种染色技术研究了半滑舌鳎消化道的组织结构特征。在认识消化系统组织学结构基础上,运用RACE方法获得了半滑舌鳎食欲素(orexin)的全长c DNA序列并对其进行特征性分析,采用实时荧光定量PCR(q PCR)技术检测了orexin m RNA在不同胚胎、仔稚幼鱼发育阶段和成鱼不同组织中的时空表达水平;最后利用原核表达技术实现了半滑舌鳎orexin A和orexin B成熟肽体外重组表达和生物活性检测,获得了具有生物活性的重组蛋白。本研究结果为揭示半滑舌鳎的摄食调控机制和开发健康养殖技术提供了基础资料和理论支撑。主要研究结果如下:1.半滑舌鳎消化道显微与超微结构研究采用解剖学、组织切片、电镜观察和两种染色技术研究了半滑舌鳎消化道的组织结构特征,观察了各部分消化道的显微和超微结构,测定了消化道各部分的黏膜褶皱数、黏膜褶皱高度、肌肉层(纵肌和环肌)厚度、黏液细胞相对密度等数量指标。结果显示:消化道可分为口咽腔、食道、食道胃、前肠、后肠等五部分。半滑舌鳎不具备结构特征明显的胃,摄食后食道后部与肠道连接部形成一个囊状膨大结构,称之为食道胃;食道前部开始出现杯状黏液细胞,整个食道以Ⅲ型黏液细胞为主,食道胃中黏液细胞以Ⅲ型为主,前肠黏液细胞以Ⅳ型为主,后肠黏液细胞以Ⅱ型为主。研究结果为认识半滑舌鳎消化与吸收生理机制及研制人工养殖用饲料提供参考资料。2.半滑舌鳎orexin的基因克隆、组织分布和早期生长发育表达特性采用RACE方法,首次从半滑舌鳎下丘脑中克隆到orexin c DNA全长序列。c DNA序列全长为734 bp,包括87 bp的5’非编码区(UTR)、417 bp的开放阅读框(ORF)和230 bp的3’非编码区(UTR),编码139个氨基酸的前体蛋白。其中包括36个氨基酸的信号肽,43个氨基酸的orexin A成熟肽、28个氨基酸的orexin B成熟肽、26个C端未知功能的肽段和两个GKR蛋白水解位点。系统进化分析表明,半滑舌鳎orexin其它鲽形目鱼类处于同一分支。定量PCR分析结果显示,半滑舌鳎orexin m RNA主要在脑中表达,此外在鳃、食道胃和脾脏中有较高表达,在其它组织中有微量表达,表明其具有广泛的表达特性。orexin m RNA在胚胎发育初期阶段未检测到表达,最早在囊胚期检测到表达,其后随胚胎发育进程呈总体升高趋势,并在胚胎即将孵化出膜期达到峰值。半滑舌鳎orexin m RNA表达水平在1-180日龄内随苗种生长发育而逐渐升高。上述结果表明orexin可能在半滑舌鳎胚胎发育和早期生长过程中中发挥重要调控作用。3.半滑舌鳎orexin A和orexin B成熟肽的重组表达及活性分析根据克隆得到的半滑舌鳎orexin全长序列,设计带酶切位点引物克隆得到orexin A和orexin B成熟肽序列。利用PCR方法将扩增片段连接到原核表达载体p ET-32a上,得到的重组质粒导入到大肠杆菌BL21后经IPTG诱导产生N端含His标签的融合蛋白。预测orexin A重组蛋白大小为24.90 k Da,orexin B重组蛋白大小为21.14k Da。以SDS-PAGE电泳检测和Sigma Scan软件分别确定orexin A和orexin B重组蛋白诱导的最佳温度分别为32°C和37°C、诱导剂浓度和表达时间均为1 mmol/L和6 h,得到的orexin A和orexin B重组蛋白最大表达量分别占细菌总蛋白的52.8%和43.5%,并主要分泌在上清液中。Western blotting免疫印迹表明获得的重组蛋白可被63His抗体特异性识别。Ni~(2+)-NTA亲和层析柱纯化获得了高纯度的半滑舌鳎orexin重组蛋白。下丘脑离体孵育实验表明,获得的orexin重组蛋白能显著影响半滑舌鳎下丘脑NPY m RNA、orexin m RNA和NPY肽水平的表达和分泌,表明获得的重组蛋白具有生物活性。研究结果可为深入探究orexin在半滑舌鳎生长发育中的作用机制及研制高效绿色的促摄食制剂提供基础资料。
【图文】：

示意图,外部形态特征,半滑舌鳎,消化道

退化为细小尖突；有咽喉齿且较为发达，有舌，口咽腔后为食道，连接口咽腔和食道胃，较短，长度仅为消化道长度的1/15左右。饱食的半滑舌鳎在食道后方形成一个临时贮存食物的食道胃（图2-1），形态上与食道分界较明显，往后延伸逐渐变细，与前肠分界不明显，颜色也无明显差异。进食消化完成后食道胃明显变小，长度和直径与肠道无差异。前肠和后肠直径和颜色均略有差异，前肠直径较后肠略大，偏乳白色，，后肠近肛门处直径变大，肠壁变薄。图 2-1 半滑舌鳎消化道外部形态特征示意图Fig.2-1 The schematic diagram of alimentary canal of Cynoglossus semilaevis2.2 消化道组织学特征食道：组织切片观察显示，食道组织分为4层（图版Ⅰ-2），由内向外依次为黏膜层、黏膜下层、肌肉层和浆膜层。食道黏膜层向食道内侧突起形成11～14条纵行褶皱（图版Ⅰ-1），为黏膜褶皱，平均高度为755.333±95.254 μm（表1）

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16 30h00min 胚体全部包卵黄图 3-1-1617 32h05min 仔鱼孵化出膜图3-1 半滑舌鳎16个胚胎发育时期Fig.3-1 16 embryonic developmental stages of Cynoglossus semilaevis注：图片对应时期见表 3-1Note：For the details of embryonic stage picture, see Tab.3-1.
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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