大菱鲆与牙鲆耐低温机制初探及连锁SNP标记筛选

发布时间：2020-05-26 09:33

【摘要】：鲆鲽鱼类大多为较高纬度分布的重要海水养殖鱼类,冬季养殖都面临着较长的低温期。其中,大菱鲆Scophthalmus maximus是由欧洲引入我国的海水养殖鱼种,-1°C到20°C均可存活,但低于8℃时其生长速率显著降低。北方养殖中,每年要经历4个月的低温,使养殖场的生产效益显著降低。牙鲆Paralichthys olivaceus是中、韩、日三国的重要海水养殖鱼类。同样,冬季的低温海水影响其生长和存活,进而影响其养殖产业的产出。而有关鲆鲽鱼类的耐低温研究才刚刚开始,其耐低温机制、育种连锁标记等研究也几乎没有系统报道。本研究对雌核发育大菱鲆低温耐受组和敏感组进行转录组和miRNA高通量测序,筛选出低温胁迫下差异表达基因和miRNA,并进行关联分析,初步阐释低温下的miRNA-TF-mRNA调控网络及其耐低温的机制。同时,研究了低温下牙鲆能量代谢的关键调控因子AMPK及其相关基因表达变化,以及细胞水平上激活剂和抑制剂对该通路的调控。并在hsp70、hmgb1以及yb-1等耐低温相关基因中筛选了牙鲆低温相关的SNP。这些结果将为鲆鲽鱼类耐低温机制阐述与育种研究提供基础数据。具体研究结果如下:1.雌核发育的大菱鲆幼鱼经0°C低温处理,获得低温耐受组(CT)和低温敏感组(CS)。对其进行RNA-seq和miRNA-seq高通量测序和分析。结果显示,相对于对照组,低温耐受组和敏感组对低温的应答在mRNA和miRNA水平上明显不同,mRNA很多上调,而miRNA的变化较少。进一步分析发现,miRNA-转录因子-mRNA网络参与了细胞周期、细胞膜组分、信号转导和昼夜节律通路的调控,从而调控大菱鲆对低温胁迫的应答。2.对牙鲆雌核发育家系的鳃、肌肉及肝脏等组织在低温下(0℃)的组织形态变化进行了研究,发现低温对鳃的组织结构影响较大,肌肉组织结构几乎没有变化,但肝脏组织却有一定的损伤,呈现细胞凋亡的趋势。进一步对牙鲆AMPK及其相关基因低温胁迫下脑、肌肉和心脏组织中差异表达图式进行了分析,并在细胞水平探讨了其调控机制。结果表明,低温激活了脑组织中LKB1、CaMKKβ及AMPK基因,AMPK又激活了SITR1、FOXO1A和TFAM;在肌肉组织中,这些基因表达呈现出先降后升的趋势,对低温的应答存在滞后现象。在细胞水平,低温和激活剂AICAR均激活了AMPK及相关基因,抑制剂CC抑制了这些基因的表达。由此可以初步推断低温下AMPK的调控机制:首先低温胁迫通过Ca~(2+)和AMP/ATP激活了LKB1和CaMKKβ,进而激活了AMPK;AMPK又激活了FOXO1A和SIRT1,从而加强糖酵解和线粒体的生物合成,产生更多的能量,并增强抗氧化能力;活化的AMPK同时抑制了HMGCR,使胆固醇生物合成受阻。总的来说,在低温胁迫中,AMPK不但参与了能量调控还参与了对低温的应答。3.对hsp70、hmgb1及yb-1基因部分序列在牙鲆低温耐受组和敏感组进行SNP分子标记筛选。分别从hsp70、hmgb1及yb-1获得了9、21和10个SNP位点。其中,hsp70和hmgb1各有3和2个SNP在低温耐受组和敏感组之间存在显著性差异;hsp70基因SNP 8的等位基因G仅出现在耐受组;hmgb1 SNP 7的基因型TT和等位基因T与耐低温相关,而基因型CC和等位基因C与低温敏感相关。单倍型分析发现,hsp70基因的单倍型TTG与牙鲆的耐低温相关,而hmgb1基因的单倍型ATG和TCT分别与低温耐受和低温敏感相关联。
【图文】：

长度分布,大菱鲆,转录本,长度分布

994 bp, unigene 的长度如图 2.2。表2.3转录组数据质量评估Table 2.3 Data output quality list of RNA-seq样品SampleRaw ReadsCleanreadsCleanbases (G)错误率Error (%)Q20 (%) Q30 (%)CT_1 39010112 37778852 4.72 0.02 96.16 91.32CT_2 38658504 37495012 4.69 0.02 96.05 91.09CT_3 36561092 35409136 4.43 0.02 96.00 91.00CS_1 34899208 33731654 4.22 0.02 95.82 90.65CS_2 41702880 40027278 5.00 0.02 95.38 89.76CS_3 36461264 35168832 4.40 0.02 95.73 90.44CG_1 35781094 34615484 4.33 0.02 95.80 90.54CG_2 35719578 34575328 4.32 0.02 95.83 90.59CG_3 32298470 31166162 3.90 0.02 95.37 89.49

差异表达,基因

41图2.5差异表达的基因 KEGG 分析Figure 2.5 Pathway classification of differentially expressed genes according to KEGG results
【学位授予单位】：中国科学院大学(中国科学院海洋研究所)
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S917.4

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