杀鱼爱德华氏菌三型效应物EseK及其分子伴侣的鉴定和功能研究
发布时间：2020-05-26 22:13
【摘要】：杀鱼爱德华氏菌(Edwardsiella piscicida)是一种胞内肠道致病菌,宿主非常广泛,能感染鱼类、两栖类、爬行动物类、鸟类和哺乳动物甚至人类。杀鱼爱德华氏菌不仅能感染上皮细胞,也能抵抗吞噬体的吞噬活性,在动物体内引起严重的疾病。杀鱼爱德华氏菌引起的爱德华病在鱼类中表现得比较明显,这些鱼类包括蓝曼龙鱼(Blue gourami fish),大菱鲆(Turbot)以及斑马鱼(Zebrafish)。杀鱼爱德华氏菌自身有两套与致病型密切相关的分泌系统,分别是三型分泌系统(Type Ⅲ secretion system,T3SS)和六型分泌系统(Type Ⅵsecretion system,T6SS)。在感染过程中,杀鱼爱德华菌会通过T3SS或者T6SS向宿主细胞注射毒力因子。这些毒力因子能影响宿主细胞中各种信号通路,使细菌在宿主体内更好地生存和增殖。三型分泌系统对沙门氏菌(Salmonella enterica)、耶尔森氏菌(Yersinia spp.)和志贺氏杆菌(Shigella spp.)等大多数病原菌来说是非常重要的。在侵染过程中,病原菌利用T3SS将效应物蛋白注射到宿主细胞内,发挥调节宿主细胞的功能,达到利于细菌生存的目的。对于杀鱼爱德华氏菌,T3SS是最重要的毒力系统之一,能帮助杀鱼爱德华氏菌在宿主细胞中生存和增殖,而更多时候T3SS是通过向宿主细胞中注射效应物蛋白来发挥功效的。因此,鉴定新的杀鱼爱德华氏菌T3SS效应物蛋白就显得非常重要,能帮助我们更好地了解宿主与病原菌之间的相互作用。在本课题中,我们以动物细胞作为研究模型,鉴定到一个新的杀鱼爱德华氏菌T3SS效应物蛋白EseK。该蛋白由基因ETAE_1586编码。EseK依赖T3SS途径被分泌到细菌胞外上清和被注射到宿主细胞内,定位于宿主细胞的膜组分中。在EseK的分泌过程中,EseK的N端20个氨基酸起到分泌信号肽的功能。在对EseK进行功能研究时,我们发现EseK不仅可以抑制宿主细胞中MAPKs信号通路的p38、JNK和ERK1/2的磷酸化,而且能抑制宿主细胞中细胞因子TNF-α的表达。在细菌中,T3SS效应物蛋白通常会伴随着一个不能被分泌的分子伴侣蛋白存在,分子伴侣通常情况下会在T3SS效应物蛋白的表达、分泌或转运中起到帮助作用。在本课题中,我们通过生物信息学分析结合细菌分泌实验、胞内转运实验以及体外表达蛋白纯化并做Pull-down实验,证实由基因ETAE_1587和ETAE_1588编码的两个蛋白EscH和EscS是T3SS效应物蛋白EseK的Ⅰ类分子伴侣蛋白。它们都能帮助EseK分泌至细菌培养上清和转运至宿主细胞中,但是对EseK的表达和降解没有影响。体外Pull-down实验表明EseK与EscH以及EseK与EscS都能直接相互作用,三种蛋白能形成一种以EseK蛋白作为接头蛋白的三联体复合物。通过对蛋白进行截断分析,进一步研究相互作用的蛋白关键区段,我们发现EscS蛋白N端的10-21氨基酸区段对EscS结合到EseK蛋白上起到重要的作用,而EscH蛋白截断后的N端部分和C端部分都对结合EseK蛋白起作用。对效应物蛋白EseK来说,N端的73-89氨基酸区段能作为一个分子伴侣结合区段(Chaperone-binding domain,CBD)与分子伴侣蛋白EscH和EscS直接相互作用。最后,斑马鱼活体实验表明,T3SS效应物EseK以及它的两个分子伴侣蛋白EscH和EscS都能帮助杀鱼爱德华氏菌在斑马鱼的肝脏和肾脏中进行定植,都对细菌发挥毒力起到一定的作用。
【图文】：
第２页逦华东理工大学博士学位激酶（ＭＡＰ３Ｋｓ）、ＭＡＰＫ激酶（ＭＡＰ２ＫＳ或者ＭＫＫｓ）以及ＭＡＰＫ。有时，在级联反除了这种三层的蛋白激酶之外，还有额外的两个蛋白激酶参与其中，分别是ＭＡＰ３ＫＳ上游的ＭＡＰ４Ｋ以及处于ＭＡＰＫ下游的ＭＡＰＫＡＰＫ。总体来说，ＭＡＰＫ反应过程是：当细胞受体接收到外界刺激信号时，将该信号转导至ＭＡＰ３Ｋｓ，ＭＡＰ３是丝氨酸／苏氨酸激酶，在真核细胞中大量存在，转导至ＭＡＰ３ＫＳ的信号会引起ＭＡＰ３的磷酸化，使ＭＡＰ３ＫＳ自身得到活化。活化后的ＭＡＰ３ＫＳ能够磷酸化其下游ＭＡＰ２的两个丝氨酸／苏氨酸残基（Ｓ／Ｔ－ＸＸＸＸＸ－Ｓ／Ｔ，Ｘ指任意氨基酸），激活ＭＡＰ２Ｋｓ。ＭＡＰ是ＭＡＰＫ的激酶，是一种双特异性的蛋白激酶。它被ＭＡＰ３ＫＳ磷酸化而被激活的是它本身的Ｓｅｒ／Ｔｈｒ发生磷酸化。被磷酸化的Ｓｅｒ／Ｔｈｒ位于ＭＡＰ２ＫＳ亚结构域ＶＩＩＩ活化ｌｏｏｐ环中。在这个ｌｏｏｐ环上，该Ｓｅｒ／Ｔｈｒ以一种保守的三肽基（Ｓｅｒ－Ｘ－Ｔｈｒ）形式［７，８］逡逑0逡逑
华东理工大学博士学位论文逡逑端激酶（ＪＮＫ）邋１，２和３邋（ＪＮＫ１，ＪＮＫ２和ＪＮＫ３）。ＥＲＫ、ＪＮＫ以及ｐ３８的异构体分类是根逡逑据它们的活性基体、结构以及功能来进行的（图１．３）［２，３］。逡逑Ｇｒｏｗｔｈ邋ｆａｃｔｏｒｓ逦Ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｖｙ邋ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ逦Ｓｔｒｅｓｓ逡逑价邋不ｃ邋ｖ逡逑－咖酬丨＿＿＿逡逑？逦？？，邋S缅义贤迹保冲澹停粒校诵藕磐芳蚧煎义希疲椋纾澹保冲澹樱椋恚穑欤椋妫椋澹溴澹停粒校隋澹螅椋纾睿幔欤椋睿珏澹穑幔簦瑁鳎幔螅澹ǎ粒╁澹牛遥耍保插澹穑幔簦瑁鳎幔澹ǎ拢╁澹穑常稿澹幔澹穑澹担澹幔睿溴澹澹穑幔簦瑁鳎幔螅澹ǎ茫╁义希剩危隋澹保插澹幔睿溴澹冲澹穑幔簦瑁鳎幔螅常义习庑藕诺鹘诩っ福牛遥耍笫怯桑牛遥耍螅焙停牛遥耍螅擦礁龌虮嗦氲摹＃牛遥耍蟮某稍卞义希牛遥耍螅卞搴湾澹牛遥耍螅插逡脖怀莆澹停粒校耍螅冲澹ǎ穑矗矗停粒校耍┖湾澹停粒校耍螅卞澹ǎ穑矗玻停粒校耍遣溉槎义衔镏凶钕缺患ǖ降模停粒校耍螅郏福荨Ｔ冢停粒校酥校牛遥耍焙停牛遥耍彩欠浅Ｏ嗨频牡鞍字剩义纤侵涞南嗨菩源锏搅隋澹罚担ィ郏保牵荨ｅ义嫌桑牛遥耍蟛斡氩⒁嫉模停粒校思读藕磐烦莆牛遥思读从Α８眉读从χ屑ゅ义匣钗镉泻芏啵热缟ひ蜃印⒓に睾椭琢龌邓酪蜃樱ǎ裕危疲悖簦┘易宓拇傺仔韵赴蜃印⒉″义显喙胤肿悠祝ǎ校粒停校螅┤绮≡⑸锏闹嗵牵蹋校印⑽Ｏ障喙胤肿悠祝ǎ模粒停校螅⒛谠葱藻义衔Ｏ招藕湃缍鲋嘌不械难趸缘兔芏戎鞍祝ǎ蹋模蹋┖屯捶缰械哪蛩峋宓鹊龋郏福荨ｅ义献魑畛＜模停粒校耍
本文编号：2682480
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