养殖鲆鲽类无眼侧黑化调控机制研究

发布时间：2020-05-27 22:41

【摘要】：本文以我国鲆鲽类主导养殖种类—半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis Günther)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)为研究对象,运用成熟肽克隆、原核表达、Western blotting和组织离体孵育等技术手段成功构建了半滑舌鳎MCH1和MCH2体外原核表达系统,得到了纯化的具有生物活性的体外重组蛋白;通过光学显微镜观察、电镜观察、统计学、分子生物学等方面的研究手段,在组织形态、血清学、mRNA水平上对池塘养殖牙鲆无眼侧黑化消褪的原因及机理进行初步探究。研究结果可为养殖鲆鲽类无眼侧黑化的机制研究提供理论与技术支撑。主要研究结果如下:1.半滑舌鳎黑色素聚集激素(MCH1)的原核表达及生物活性分析根据半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)MCH1的cDNA序列设计特异性引物扩增成熟肽片段,利用原核表达载体pET-32a成功构建了重组MCH1/pET32a质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导产生重组蛋白。半滑舌鳎MCH1重组蛋白大小为29.9KD,32℃条件下以0.2mmol/LIPTG诱导6h时重组蛋白表达量最高,占菌体总蛋白的50%。Western blotting免疫印迹表明MCH1重组蛋白可被6×His抗体特异性识别。经Ni2+-NTA亲和柱纯化,可获得高纯度的MCH1重组蛋白。采用垂体离体孵育方法测试蛋白活性,MCH1重组蛋白可有效刺激或抑制垂体MCH和MSH肽的分泌,MCH肽水平先上升后下降,在100nmol/L达到峰值,MSH肽水平显著升高。随着外源MCH1重组蛋白浓度的增加,垂体MCH1和MCH2 mRNA表达都呈现先上升后下降的趋势,POMC-a和PACAP mRNA表达都呈现明显下降趋势,而POMC-b、MCHR1、MCHR2、MITF基本没有变化,表明获得的半滑舌鳎MCH1重组蛋白具有调节垂体激素分泌和基因表达的生理功能。研究结果可为研制半滑舌鳎无眼侧黑化调控的专用生物制剂提供理论与技术依据。2.半滑舌鳎黑色素聚集激素(MCH2)的原核表达及生物活性分析根据半滑舌鳎MCH2的cDNA序列设计特异性引物扩增成熟肽片段,利用原核表达载体pET-32a成功构建了重组MCH2/pET32a质粒,转化大肠杆菌BL21(DE3)后经IPTG诱导产生重组蛋白。半滑舌鳎MCH2重组蛋白大小为32.1KD,27℃条件下以0.2mmol/LIPTG诱导6h时表达量最高,占菌体总蛋白的55%。Western blotting免疫印迹表明MCH2重组蛋白可被6×His抗体特异性识别。经Ni2+-NTA亲和柱纯化,可获得高纯度的MCH2重组蛋白。采用垂体离体孵育方法测试蛋白活性,MCH2重组蛋白可有效刺激垂体MCH和MSH肽的分泌,孵育液中MCH肽水平显著升高,在1000nmol/L达到峰值,MSH肽水平在1000nmol/L才开始显著升高。随着外源MCH2重组蛋白浓度的增加,垂体MCH1和MCH2 mRNA表达都呈现先上升后下降的趋势,POMC-a和PACAP mRNA表达都呈现明显升高趋势,而POMC-b表达却呈现明显下降趋势,同时MCHR1、MCHR2、MITF基本没有变化,表明获得的半滑舌鳎MCH2重组蛋白具有调节垂体激素分泌和基因表达的生理功能。3.池塘养殖牙鲆无眼侧体色黑化消褪机理初步研究养殖生产中发现,无眼侧发生黑化的牙鲆在池塘养殖一段时间后,其无眼侧黑化程度呈现出逐步消退直到正常。针对这种池塘养殖牙鲆无眼侧黑化消褪的现象,我们从形态学、血清学和mRNA水平上对其可能的生理学机制进行了研究。形态学观察表明,牙鲆无眼侧黑化消褪区域的黑色素细胞数量显著少于有眼侧和无眼侧黑化消褪区域,无眼侧黑化消褪过程中黑化区域的鳞片类型经历了栉鳞→弱栉鳞→圆鳞逐渐转变的过程。随着无眼侧黑化的减弱,栉鳞上硬棘数量也随之减少。测定了无眼侧黑化、无眼侧正常和无眼侧发生消褪的牙鲆血清中两种体色相关肽,结果发现无眼侧黑化消褪的牙鲆血清中MCH肽的含量显著高于其他两种牙鲆。同时无眼侧皮肤黑化的牙鲆血清中MSH肽的含量显著高于其他两种类型的牙鲆。基因表达分析表明,无眼侧黑化消褪鱼垂体MCH mRNA表达水平显著高于无眼侧黑化鱼,而垂体POMC1 mRNA表达水平显著低于无眼侧黑化鱼,都与无眼侧正常鱼无显著差异。无眼侧黑化消褪鱼脑MCH mRNA表达水平与无眼侧黑化鱼无显著差异,但显著低于无眼侧正常鱼。无眼侧黑化消褪鱼POMC1mRNA表达水平显著低于其他两种鱼,无眼侧正常鱼和黑化鱼无显著差异。研究结果可为建立池塘养殖牙鲆无眼侧黑化消褪的调控技术提供理论依据。
【图文】：

半滑舌鳎,重组表达,菌液,PCR鉴定

行 5 倍梯度稀释成 6 个标准0.85<E<1.1。行三次平行试验，每次试验增特异性，每次试验均设置空基因的相对表达量[75]。.0 版本)统计，对激素表达水OVA)，设置差异显著性水平较使用 SPSS(17.0 版本)进行的构建熟肽序列连接到表达质粒肠杆菌 BL21 中，菌液 PC析可知目的基因插入完全正

序列,半滑舌鳎,成熟肽,序列

13图 2-2 半滑舌鳎 MCH1 重组成熟肽序列注:阴影部分为起始密码子 ATG，*表示终止密码子 TAA，双下划线部分为 6×His tag，方框表示限制性内切酶位点 BamH I、Hind IIIFig.2-2 The matured peptide sequence of MCH1 of Cynoglossus semilaevisNotes: The initiation codon (ATG) is shaded.The stop codon(TAA) is marked by asterisk. The6×His tag is double underlined. The endonuclease BamH I and Hind III are boxed2.2 重组质粒在大肠杆菌 BL21(DE3)中的表达将重组质粒MCH1/pET-32a进行诱导表达，诱导得到的MCH1重组菌在25kD和 30kD 之间出现特异性条带，，此条带为 MCH1 重组蛋白，大小为 29.9kD。由图可以看出，重组菌蛋白表达量在不同的条件下存在明显差异，得到重组表达的最优条件为 32℃、IPTG(0.2mmol/L)诱导培养 6h。重组蛋白表达量经测定占细菌总蛋白的 50%(图 2-3,2-4,2-5)。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S917.4

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