【摘要】：黄河鲤(Cyprinus carpio haematopteus)作为我国淡水养殖鱼类的重要品种之一。近年来,在其养殖过程中,维氏气单胞菌(Aeromonas veronii)已成为主要致病菌之一,极大的威胁了我国水产养殖的健康发展,针对该菌感染,目前培养具有抗病能力的品种是有效的防治措施之一。主要组织相容性复合体(Major histocompatibility complex,MHC)是在脊椎动物中发现的与机体免疫相关的高度多态的基因群,在鱼类中由于其高度的多态性,使其在结构、功能、多态、表达及抗病性等方面备受关注。本研究以黄河鲤为研究对象,人工腹腔注射维氏气单胞菌后,研究其MHCⅡ类DAA及DAB等位基因的分布,讨论其与鱼体抗病力的相关性,同时又采用实时荧光定量PCR方法,检测MHCⅡ类DAA及DAB基因在正常组织中的表达情况及在感染不同时段表达量的变化趋势,为黄河鲤的分子育种与选育提供理论基础和重要依据,结果如下:1基于维氏气单胞菌感染的黄河鲤MHCⅡDAA基因的多态性与抗病力的关系本研究从33尾黄河鲤(17尾抗病个体和16尾易感个体)c DNA中扩增了长度为437bp的MHCⅡDAA基因片段,该基因片段编码部分信号肽、完整的a1、a2及部分a3结构域。共测序165个有效克隆,核苷酸和氨基酸的变异率分别为40.95%(172/420)、65%(91/140)。共获得54个不同的等位基因,各等位基因的频数及其各主型中亚型的数目都不均衡,其中等位基因Cyca-DAA*0101、Cyca-DAA*1502出现的频数最大,分别为0.1212和0.0909。有4个等位基因在抗病群体及易感群体中均有出现,等位基因Cyca-DAA*0101在抗病群体出现的频率为9.09%,而在易感群体出现的频率仅为3.03%,差异极显著(P0.01)。29个等位基因为抗病群体特有,Cyca-DAA*0901(5.45%)(P0.01)所占比例最大,有19个等位基因与黄河鲤对维氏气单胞菌的易感性相关,其中Cyca-DAA*1502(9.09%)(P0.01)所占比例最大。经结构分析,发现抗原结合位点(PBR)和非抗原结合位点(non-PBR)的比值(d N/d S)分别为2.556和0.769,说明正向选择机制在黄河鲤MHCⅡDAA基因的自然进化过程中占主导地位。荧光定量PCR结果表明MHCⅡDAA基因在健康黄河鲤的9个组织中均有表达,其中较强表达于肾、肝、肠、脾,在心脏、鳃、脑表达量有所降低,而表达量最低的组织为肌肉和眼。人工感染维氏气单胞菌后,DAA基因在感染不同时段肝、脾、肾、肠组织中表达量有所变化,表明MHCⅡDAA基因在黄河鲤抵抗病原的侵入过程中起着重要作用。2基于维氏气单胞菌感染的黄河鲤MHCⅡDAB基因的多态性与抗病力的关系本研究在17尾抗病个体和16尾易感个体黄河鲤c DNA中扩增了包括部分信号肽结构、完整的β1结构及部分β2结构的长度为327bp基因片段。测序165个有效克隆共获得72个等位基因,核苷酸和氨基酸的变异位分别为221、104,变异率为67.58%和100%。每个个体为多基因座及每个基因座都含有数量众多的等位基因,出现频率较高的等位基因为Cyca-DAB*0801(0.151)、Cyca-DAB*1001(0.0909)、Cyca-DAB*0701(0.0788)。5个等位基因在抗病群体及易感群体中均有出现,其中Cyca-DAB*0202、Cyca-DAB*1001在易感群体中出现的频率显著(P0.05)高于抗病群体中出现的频率,而在抗病群体中,Cyca-DAB*0101出现的频率明显大于在易感群体出现的频率,差异极显著(P0.01)。有38个等位基因与黄河鲤对维氏气单胞菌的抗性相关,各等位基因分布的频率差异不显著,29个等位基因与黄河鲤对维氏气单胞菌的易感性相关,其中等位基因Cyca-DAB*1001出现的频率最高(9.09%),差异极显著(P0.01)。非同义替代与同义替代的比率(d N/d S)在PBR和非PBR结合区分别为2.556和0.898,证明平衡选择是黄河鲤存在众多DAB等位基因的发生机制。荧光定量PCR结果显示在健康黄河鲤肝、肾、脾、鳃等9个组织中均能扩增出MHCⅡDAB基因,结果显示DAB基因在肾、肝、脾、鳃中高度表达,中等表达于心脏、肠道,在脑、眼、肌肉表达量最低。黄河鲤在感染维氏气单胞菌后,组织中MHCⅡDAB基因的表达水平变化较大的组织分别为肝、脾、肾、鳃,说明MHCⅡDAB基因在黄河鲤的免疫反应中起着重要作用。
【学位授予单位】：吉林农业大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2016
【分类号】：S943
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