中国地区一株新型黄头病毒的分子流行病学

发布时间：2020-06-09 04:02

【摘要】：近年来,对虾养殖业作为我国的重要产业迅速发展,随着养殖规模的扩大和集约化的养殖模式推广,对虾病害在我国呈高发趋势,我国每年因对虾病害造成的损失多达数十亿元。对虾黄头病是重要的对虾病害之一,二十年来给世界对虾养殖造成严重损失。该病毒致病力强,一旦感染发病,死亡率很高,且很难防治。该病多发生于东南亚及澳洲地区,此前从未对我国养殖对虾造成损失。2012年,我们采用OIE检测手册的YHV套式RT-PCR方法首次从河北地区的发病对虾内检测到该病毒,并进行了进一步的研究。为查明YHV在我国的存在和变异情况,本研究采用世界动物卫生组织(OIE)《水生动物诊断手册》中YHV套式RT-PCR检测方法对2012-2014年采集的299份样品进行了YHV监测,并对部分YHV阳性样品基因进行了克隆测序及系统发育分析。流行病学调查表明,299份样品中YHV的阳性率为11%,我国养殖的中国明对虾、凡纳滨对虾、日本囊对虾以及罗氏沼虾的部分样品中均检出了YHV阳性,中国明对虾和罗氏沼虾是本次调查中新发现的YHV自然宿主,而且YHV在中国明对虾中的检出率最高,调查结果对增补YHV的宿主范围有重要意义。对6份较强阳性样品YHV基因组ORF1b内1002bp的分型片段进行克隆测序和序列分析,序列比对结果显示阳性样品的YHV与目前已知YHV的6个基因型相似度为81.0%~90.5%,系统发育树分析显示6份阳性样品归于同一分支,但与已知YHV的6个基因型均不在同一分支内,其与YHV基因1型亲缘关系较近。对阳性样品YHV基因组ORF3内编码gp116蛋白的一段序列进行克隆测序,发现其序列长度为509bp,与YHV1-a型的545bp、YHV 1-b型的383bp和YHV-2型的476bp均不同;依据该片段构建的系统发育树显示,6份阳性样品归于同一分支,与YHV已知的6个基因型不同,其与YHV-1型亲缘关系较近,且与YHV1-a型相似度大于YHV1-b型。对其中2份样品的ORF2序列进行比对发现,2份样品序列相似性为99.8%,蛋白序列完全相同,与YHV-1型的序列相似度为85.9%,与GAV相似性为80.9%。通过YHV核酸检测和序列比对结果表明,感染我国养殖对虾的YHV为一种新的株型。这为研究我国对虾新发疫病的病原学病因提供了重要信息,该结果也表明我国养殖对虾正面临着新的病害威胁。本研究在YHV中国株全基因组序列的基础上,通过对YHV中国株和YHV已知株系的全基因组进行比对发现,YHV中国株与YHV已知株系全基因组的相似度为75.4%-82.3%,其中ORF2内约200bp片段与已知YHV基因型为共同保守序列,ORF1内CR2片段存在约250bp序列保守性更高。并根据CR2内保守序列设计相关的LAMP通用引物,对YHV病毒所有基因型进行检测。YHV的致病性基因型主要为YHV-1型,为研究本实验室新发现YHV病毒的致病力,挑选20120706(河北唐海)、20131018(青岛即墨)样品进行人工感染凡纳滨对虾实验,结果显示,20120706样品的累计死亡率为75%,20131018样品的累计死亡率为93.33%,这与YHV-1型的高死亡率相似,说明YHV中国株为致病性毒株。此前,研究者从世界各地的患病对虾中已分离到YHV的6个基因型,更多基因型正在陆续被发现,根据我们实验室已发表的部分基因序列,泰国学者将YHV中国株暂命名为YHV-9。我国新发YHV与这些已知基因型在进化上的亲缘关系如何,发病对虾的种类和地区分布均尚无报道。本研究通过流行病学调查及YHV-9基因测序的基础上,对我国不同地理区域YHV样品ORF1、ORF2和ORF3序列与已知YHV株系的同源性进行分析,以期阐明YHV中国株与已知YHV株系在进化上的关系,丰富对YHV基因组变异和进化的认识,为YHV的有效防治提供基础理论知识。
【图文】：

检测结果,中国明对虾,山东,样品

就能出现明亮的 794bp 的目的条带（图 2-1 a,b），，其中 2 份来自山东的中国明对虾样品阳性强，其他 4 份样品阳性较弱。6 份样品编号分别为 20130301-ZJ（广东，凡纳滨对虾）、20130902-JX（浙江，罗氏沼虾）、20120706-TH（河北，中国明对虾）、20140707-JM（山东，中国明对虾）、20131018-JM（山东，中国明对虾）、20120628-HG（天津，凡纳滨对虾）。M 1 2 3 4 5 6 B P1 2 3 4 5 6 B P M

对虾,品种,样品,阳性对照

Fig. 1 Result of detecting YHV by nested RT-PCRM: Marker；B: 空白对照；P: 阳性对照；a: 样品第一步 PCR 结果；b: 样品第二步 PCR 结1：20130301-ZJ；2：20130902-JX；3：20120706-TH；4：20140707-JM；5：20121018-JM；20120628-HG
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S945.4

【共引文献】