基于代谢组学的温度对罗非鱼链球菌病的影响和调控方法研究

发布时间：2020-06-09 05:59

【摘要】：罗非鱼是我国南方的重要淡水养殖鱼类。近年来,由无乳链球菌(Streptococcus agalactiae,SA)导致的链球菌病具有高发病率和高死亡率,每年高温期均大面积爆发,对罗非鱼产业造成巨大影响,经济损失巨大,成为制约罗非鱼养殖业可持续健康发展的最主要因素。目前。对罗非鱼链球菌病仍缺乏安全高效的防控方法,迫切需要开展与其致病机制相关的研究,为寻找罗非鱼链球菌病的有效防治途径奠定基础。温度是影响罗非鱼链球菌病爆发的重要环境因子之一。为了解温度对宿主和病原菌生理状态的影响,本文选取从患病罗非鱼分离的无乳链球菌致病菌株PBSA05和PBSA52,考察了其在25℃、30℃和35℃的生长情况和部分毒力因子的变化,并检测了宿主尼罗罗非鱼在不同水温时的血清非特异性免疫指标。结果表明,在本研究的3个实验温度下,两株无乳链球菌菌株的生长速度与温度呈正相关,且35℃时的最高菌浓度比其他2个实验温度下略有增加;菌株的溶血能力也与温度呈正相关,35℃时的溶血能力均显著高于25℃;对惰性基质的非特异性粘附和对罗非鱼体表粘液的特异性粘附随温度升高而显著增强。菌株PBSA05在30℃培养时透明质酸酶活性最高,25℃培养时透明质酸酶的活性最低,菌株PBSA52的透明质酸酶活性受温度影响不明显。以罗非鱼全血孵育2株致病菌,高温培养菌的存活率显著增加。不同温度对罗非鱼血清非特异性免疫的影响研究结果表明,罗非鱼血清总抗氧化能力随温度增加而降低,35℃时总抗氧化能力显著低于25℃时;碱性磷酸酶活性随温度升高而下降,35℃时的酶活力显著低于25℃。血清溶菌酶活性在30℃时显著高于25℃和35℃,在35℃时活性最弱。罗非鱼血清超氧化物歧化酶和补体C3的活力在不同实验温度下无显著变化。以3×107 CFU/mL菌液对罗非鱼进行腹腔注射感染(0.1mL/尾),结果菌株PBSA05和PBSA52在25℃对罗非鱼的致死率分别为38.33%和16.67%,35℃时的致死率为分别为81.67%和71.67%。上述结果表明温度变化影响病原菌和宿主的生理状态,两者共同作用导致不同温度下罗非鱼链球菌病的发病率和危害程度明显不同。为了从代谢水平上阐明温度变化对病原体的影响,通过超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS)技术结合模式识别方法和代谢途径分析,研究了致病性无乳链球菌PBSA05和PBSA52在25℃和35℃进入稳定期时的胞内代谢物组。从两株菌种共找到34种变化一致的代谢物作为无乳链球菌受温度影响的潜在生物标志物。无乳链球菌在不同温度下的代谢状态明显不同,温度变化对核酸代谢、糖代谢、氨基酸代谢和脂类代谢均有影响。35℃时大量核苷酸及其衍生物,能量物质、细胞壁的组分和与应激调节物质,如甘油醛-3-磷酸、焦谷氨酸、谷氨酸、D-丙氨酰-D-丙氨酸、甘油磷酸胆碱、脱磷酸乙酰辅酶A、氧化型谷胱甘肽的含量显著增加。而甘露糖、麦芽三糖、6-磷酸乙酰葡糖胺、尿嘧啶、脯氨酸和瓜氨酸等形成荚膜、抗原和毒力蛋白的前体物质在高温时含量降低。代谢的变化主要与无乳链球菌的能量代谢、碳源的选择性利用、核苷酸水平、蛋白质和细胞结构物质合成以及应激状态有关。高温下稳定期的无乳链球菌代谢活性降低,但对环境的适应性增强,对宿主粘附、定植、入侵和抵抗免疫清除的能力增强。本研究首次确定了无乳链球菌对温度变化的代谢响应,其结果有助于揭示其致病机制,并为寻找有效的罗非鱼链球菌病防控方法奠定了理论基础。采用基于气象色谱串联质谱(GC/MS)技术的代谢组学方法比较了罗非鱼在水温为25℃和35℃时的血清代谢谱,采用主成分分析(PCA)和偏最小二乘判别分析(PLS-DA)模型可以根据检测到的278个有效峰将不同温度的血清样本点分开。利用t检验(p0.1)结合正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)分析(投影重要度,VIP1.0),从识别出的87种代谢物中筛选到17种差异代谢物。35℃时罗非鱼血清中的肌醇、核糖、N-乙酰甘露糖胺、羟胺、乳酸、3,6-脱水半乳糖、氨基甲酰基天冬氨酸、甘油酸、a-酮戊二酸、戊二酸、3-羟基脯氨酸和3-羟基甲基戊二酸含量比25℃时上升,而木糖、鸟苷、油酸、棕榈油酸和N-乙酰半乳糖胺的含量比25℃时下降。代谢途径分析显示,罗非鱼的甘油脂代谢、磷酸肌醇代谢、戊糖和葡萄糖醛酸转换、三羧酸循环、丙氨酸天冬氨酸和谷氨酸代谢、嘌呤代谢受到温度变化的影响。高温环境使罗非鱼能量代谢受到扰动,氨基酸分解增强,蛋白质合成减慢,脂肪分解加速。通过灌胃和腹腔注射两种方式对罗非鱼外源性补充木糖,结果表明,通过腹腔注射补充木糖可以提高罗非鱼的血清总抗氧化能力和碱性磷酸酶活性,而通过灌胃补充木糖对上述两种血清非特异性免疫指标无显著影响。研究结果为提高罗非鱼对高温环境的适应性,预防高温期链球菌病的发生提供了参考。对25℃和35℃感染无乳链球菌的罗非鱼血清进行GC/MS代谢组学分析,比较不同温度下罗非鱼感染无乳链球菌后的血清代谢谱变化。结果表明,25℃组和35℃组感染无乳链球菌的罗非鱼与未感染罗非鱼的血清样本均可以通过OPLS-DA模型分开。血清中受到较大影响的代谢物是碳水化合物和脂类物质。35℃时罗非鱼对感染无乳链球菌的代谢响应比25℃时更强烈。以OPLS-DA结合变化倍数(VIP1.0,Foldchange1.2或0.8)作为判断标准,从25℃和35℃组分别筛选到21种和27种潜在代谢标志物。罗非鱼感染无乳链球菌后,25℃组有6条代谢途径受到影响,35℃组有8条代谢途径受到影响,其中共同包含的代谢途径是花生四烯酸代谢、糖酵解或糖异生和磷酸戊糖途径。感染无乳链球菌使罗非鱼血清中6-磷酸葡萄糖的含量增加,2,6-二磷酸果糖和花生四烯酸含量降低,表明糖酵解受到抑制,花生四烯酸代谢相关的炎性反应增强,并且糖代谢受阻碍的程度与罗非鱼在不同温度下的发病程度相关。对人工感染无乳链球菌的罗非鱼通过腹腔注射外源性补充1,6-二磷酸果糖作为糖酵解促进剂,5mg/尾和1Omg/尾,每天1次,连续5天,分别使罗非鱼存活率从31.11%提高至42.22%和57.78%。利用功能代谢组学调整代谢网络对无乳链球菌引起的罗非鱼链球菌病进行调控,为进一步探讨罗非鱼链球菌病的发病机制和寻找有效防治方法奠定了基础。
【图文】：

？逦－％邋ｆｔ逡逑图２－２不同培养温度的无乳链球菌荚膜和细菌形态逡逑Ｆｉｇ．邋２－２邋Ｔｈｅ邋ｃａｐｓｕｌａｒ邋ｏｆ邋Ｓ．邋ａｇａｌａｃｔｉａｅ邋ａｔ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｃｕｌｔｕｒｅ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓ逡逑注：图中箭头表示荚膜位置逡逑Ｎｏｔｅ：邋Ｔｈｅ邋ａｒｒｏｗｓ邋ｒｅｐｒｅｓｅｎｔ邋ｔｈｅ邋ｌｏｃａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ｃａｐｓｕｌａｒ．逡逑３３逡逑

３．２环境温度对罗非鱼非特异性免疫力的影响逡逑３．２．１温度对罗非鱼血清总抗氧化能力的影响逡逑对不同水温中的罗非鱼血清总抗氧化能力进行检测，结果显示（图２－６），水温逡逑为２５°Ｃ、３０°Ｃ和３５°Ｃ时，罗非鱼血清的总抗氧化能力随温度上升而降低（；？＜０．０５），逡逑３５°Ｃ时的血清抗氧化能力显著低于２５°Ｃ、３０°Ｃ时。逡逑８－，，逡逑｜邋｜邋＿逡逑。Ｈ逦Ｈ逦Ｂｂ！逡逑ｗ逦Ｉ逦ｉ逦Ｉ逡逑２５°Ｃ逦３０°Ｃ逦３５°Ｃ逡逑温度逡逑图２－６温度对罗非鱼血清总抗氧化能力的影响逡逑Ｆｉｇ．邋２－６邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ｏｎ邋ａｎｔｉｏｘｉｄａｔｅ邋ａｃｔｉｖｉｔｙ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ邋ｓｅｒｕｍ逡逑３．２．２温度对罗非鱼血清ＳＯＤ活性的影响逡逑不同温度下罗非鱼血清ＳＯＤ活性测定及统计分析结果见图２－７。２５１时罗非鱼血逡逑清ＳＯＤ活力最低，３５°Ｃ时ＳＯＤ活力略高于其他温度时，但各组间无显著性差异逡逑（；？＞０．０５）邋0逡逑１００１逦ａ逦ａ逦ａ逡逑＾邋８０邋－逦Ａ邋ｊ邋ＦＨｌｃ？逡逑ｉ：逡逑Ｕ邋－ｊ逦ｉ逦！逦１逡逑２５°Ｃ逦３０°Ｃ逦３５°Ｃ逡逑温度逡逑图２－７温度对罗非鱼血清ＳＯＤ的影响逡逑Ｆｉｇ．邋２－７邋Ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ＳＯＤ邋ｏｆ邋ｔｉｌａｐｉａ逡逑３．２．３温度对罗非鱼血清溶菌酶活性的影响逡逑从图２－８可以看出，３０°Ｃ组的罗非鱼血清溶菌酶活性最强，显著高于２５°Ｃ组和３５°Ｃ逡逑组（ｐ＜０．０５）
【学位授予单位】：海南大学
【学位级别】：博士
【学位授予年份】：2017
【分类号】：S943


本文编号：2704259