黄颡鱼两种类固醇合成酶复制基因部分cDNA的克隆及EE2对其表达的影响
发布时间：2020-06-11 17:55
【摘要】：性类固醇激素在硬骨鱼的性别分化、繁殖和生长等过程中都扮演着极其重要的角色,特别是雌激素在性别分化和性成熟过程中起决定性作用。而P450c17和20β-HSD在合成鱼类性类固醇激素和孕激素的过程中不可或缺。本研究通过RT-PCR及RACE方法,从三峡库区重要的经济养殖鱼类——黄颡鱼中克隆了P450c17和20β-HSD的复制基因:P450c17α-II和20β-HSD-I的部分c DNA序列。序列分析结果发现,P450c17α-II和20β-HSD-I片段长度分别为1203bp和1198bp。多重序列对比显示,黄颡鱼P450c17α-I、-II均具有P450c17保守的Ono序列、十三肽和血红素结合区域。20β-HSD-I、II均具有20β-HSD保守的辅酶结合区域、辅酶腺苷酸接合位点、稳定β-折叠的结构、部分激活位点、底物接合位点、催化部位和酰胺烟酰胺环结构。相似性分析表明,黄颡鱼P450c17α-I、-II均与同为鲇形目的斑点叉尾洶和南方鲶相似性最高,与四足类相似性较低。20β-HSD-I、-II与斑点叉尾洶和革胡子鲶相似性最高,与四足类相似性较低。随后,本研究还对上述基因的表达模式进行了研究,结果表明,黄颡鱼P450c17α-I、-II在精巢和卵巢中均有表达,且P450c17α-II在头肾中也有表达;而20β-HSD-I、-II呈现的是泛表达模式,在多种组织均有表达。季节表达模式研究结果表明,黄颡鱼雄鱼和雌鱼P450c17α-I在1月表达量最;20β-HSD-I在11月表达量最;而P450c17α-II、20β-HSD-II在5月表达最高。随着现代人类日常活动的日益频繁,内分泌干扰物带给人类和动物健康的影响也越来越大,关注度也随之增加。其中,对具有类雌激素效应药物的研究已逐渐成为热点。本研究用类雌激素——乙炔基雌二醇(EE2,100ng/L)对黄颡鱼(全雄)进行暴露处理(7、14和28天)。处理结束后,用组织学和半定量RT-PCR(Semi-quantitative RT-PCR)研究了EE2对黄颡鱼雄鱼性腺发育和精子发生的影响,及P450c17α-I、-II和20β-HSD-I、-II m RNA的表达变化,所得结果和结论如下:EE2暴露处理后黄颡鱼的精巢受到严重影响(暴露后14、28天),表现为性腺发育和精子发生延迟、停止,并出现生殖细胞大量减少,体细胞明显增生的现象。基因表达的研究发现,EE2处理后P450c17α-I,-II和20β-HSD-I的表达均被明显抑制,且呈时间依赖性;而20β-HSD-II表达无明显变化。
【图文】：
重庆师范大学硕士学位论文 1 绪论羟化酶活性和 17，，20 裂解酶活性的 P450c17-I 和仅具有 17α-羟化酶活性的P450c17-II。P450c17-I cDNA 已经在许多的硬骨鱼类中被克隆和鉴定，其中包括青溕[53]，虹鳟[54]，革胡子鲶(Clarias gariepinus)[55]，斑点叉尾洶（Ictalurus punctatus）[56]，胖头kr(Pimephales promelas)[57]和斑马鱼(Danio rerio)[58]等。而 P450c17-II 则仅在部分硬骨鱼类中发现。细胞色素 P450c17 是脊椎动物内类固醇激素生成途径中最为关键的酶类之一。它是一种微粒体酶, 具有两种活性(17α-羟化酶、17，20-裂解酶)[59,60]，并在性腺类固醇激素的合成(雄激素合成的限速酶和雌激素)中起重要作用。它主要催化的两个反应分别是：C21 类固醇激素（孕酮）C17 位羟基化，17α-羟基孕酮浓度上升，促使肾上腺皮质激素的合成，并参与合成卵巢中相关性腺类固醇激素（E2）的前体物质；C21-类固醇上 17-20 碳键断裂，产生 C19 性腺类固醇激素合成的前体物质：脱氢表雄酮和雄烯二酮[61]（图 1-3）。
士学位论文 2 黄颡鱼两种类固醇合成酶复制基因 cDNA 的克隆10gct：5gaOH 调 pH 值到 7.0，加蒸馏水定容至 1L，高压灭菌（121o霉素储备液：将 1g 氨苄青霉素溶于蒸馏水定容到 10mL 配成菌，于-20°C 保存。使用时稀释为 100μg/ml。备液：20mgX-gal 溶于 1ml 二甲基甲酰胺中，避光储存于取 2g IPTG 溶于 8ml 蒸馏水中，定容至 I0ml，用 0.22μM 的菌，分装成 lml 每份的储备液，贮存于-20°C。菌株：质粒 pMD19-T 的物理图谱如图 1.2，DH5α 感受态细。
【学位授予单位】：重庆师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
【分类号】：S917.4
本文编号：2708251
【图文】：
重庆师范大学硕士学位论文 1 绪论羟化酶活性和 17，，20 裂解酶活性的 P450c17-I 和仅具有 17α-羟化酶活性的P450c17-II。P450c17-I cDNA 已经在许多的硬骨鱼类中被克隆和鉴定，其中包括青溕[53]，虹鳟[54]，革胡子鲶(Clarias gariepinus)[55]，斑点叉尾洶（Ictalurus punctatus）[56]，胖头kr(Pimephales promelas)[57]和斑马鱼(Danio rerio)[58]等。而 P450c17-II 则仅在部分硬骨鱼类中发现。细胞色素 P450c17 是脊椎动物内类固醇激素生成途径中最为关键的酶类之一。它是一种微粒体酶, 具有两种活性(17α-羟化酶、17，20-裂解酶)[59,60]，并在性腺类固醇激素的合成(雄激素合成的限速酶和雌激素)中起重要作用。它主要催化的两个反应分别是：C21 类固醇激素（孕酮）C17 位羟基化，17α-羟基孕酮浓度上升，促使肾上腺皮质激素的合成，并参与合成卵巢中相关性腺类固醇激素（E2）的前体物质；C21-类固醇上 17-20 碳键断裂，产生 C19 性腺类固醇激素合成的前体物质：脱氢表雄酮和雄烯二酮[61]（图 1-3）。
士学位论文 2 黄颡鱼两种类固醇合成酶复制基因 cDNA 的克隆10gct：5gaOH 调 pH 值到 7.0，加蒸馏水定容至 1L，高压灭菌（121o霉素储备液：将 1g 氨苄青霉素溶于蒸馏水定容到 10mL 配成菌，于-20°C 保存。使用时稀释为 100μg/ml。备液：20mgX-gal 溶于 1ml 二甲基甲酰胺中，避光储存于取 2g IPTG 溶于 8ml 蒸馏水中，定容至 I0ml，用 0.22μM 的菌，分装成 lml 每份的储备液，贮存于-20°C。菌株：质粒 pMD19-T 的物理图谱如图 1.2，DH5α 感受态细。
【学位授予单位】：重庆师范大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2015
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本文编号：2708251
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