罗非鱼性别相关微卫星标记的筛选及其在全雄罗非鱼育种中的应用

发布时间：2020-07-16 02:52

【摘要】：罗非鱼是世界重要的淡水鱼类养殖品种,其性成熟时间早,性成熟后产卵周期短,并且雄鱼比雌鱼更具生长优势,如果雌雄混养会因群体内自繁进而造成罗非鱼养殖密度过大,规格参差不齐,对罗非鱼的养殖生产造成巨大影响,因此目前罗非鱼的商业化生产主要依靠雄性的单性养殖。罗非鱼“粤闽1号”是由本研究团队培育的全雄罗非鱼新品种,该品种罗非鱼为遗传雄鱼,不直接经过激素处理,具有优良的生长性能。在罗非鱼“粤闽1号”的育种路线中,XY转化雌鱼以及YY_1超雄鱼等基因型罗非鱼需要通过传统的测交实验进行鉴定,但测交筛选YY超雄鱼的过程复杂、周期长。本研究通过对尼罗罗非鱼最佳雌化条件进行探索,培育XY转化雌鱼和YY超雄鱼,并筛选罗非鱼性别相关的微卫星标记鉴定XY转化雌鱼和YY超雄鱼,其目的有二:一方面缩短罗非鱼“粤闽1号”育种周期并降低成本,另一方面为罗非鱼遗传性别的鉴定提供参考。取得的主要成果如下:1.尼罗罗非鱼和奥利亚罗非鱼性别相关微卫星标记的筛选应用24对微卫星引物,首先使用常规PCR及聚丙烯酰胺凝胶电泳的方法在两个尼罗罗非鱼群体和两个奥利亚罗非鱼群体中筛选到UNH931、GM128、GM201、GM258、GM597以及UNH898共6个与性别相关的微卫星标记。之后使用降落PCR以及毛细管电泳的方法在两个尼罗罗非鱼群体、两个奥利亚罗非鱼群体以及ZY_1、WY_1、YY_1和YY_2型罗非鱼群体中进一步扩增这6个微卫星标记,统计各群体的遗传多样性参数:6个微卫星标记在上述群体共298个样本中共检测到95个等位基因,其大小在97~302 bp之间,各位点在各群体等位基因数在1~13个之间,各群体平均观测等位基因数为2.167~9.333,平均有效等位基因数为1.624~4.966,平均观测杂合度为0.324~0.983,平均期望杂合度为0.329~0.782,平均多态信息含量为0.275~0.753,两个尼罗罗非鱼群体、WY_1和YY_2群体达到高度多态(PIC0.5),两个奥利亚罗非鱼群体、ZY_1和YY_1群体为中度多态(0.25PIC0.5)。聚类分析显示所有群体聚为两大支,两个奥利亚罗非鱼群体以及ZY1群体聚为一支,两个尼罗罗非鱼群体、WY_1、YY_1以及YY_2群体聚为另一支。进行性别关联分析发现:GM597与尼罗罗非鱼无锡群体、尼罗罗非鱼高要群体以及奥利亚罗非鱼番禺群体的性别显著相关(P0.05),UNH898与尼罗罗非鱼高要群体的性别极显著相关(P0.01)。利用GM597与UNH898联合分析可100%鉴定两个尼罗罗非鱼群体的性别。由于GM597与两个尼罗罗非鱼群体的性别均达到显著相关,可将GM597作为筛选XY转化雌鱼和YY超雄鱼的候选标记。2.吉富罗非鱼雌化条件的探索及微卫星标记GM597的扩增验证以经过测交验证基因型的吉富罗非鱼为亲本构建全同胞家系,33~#XX雌鱼与36~#YY超雄鱼杂交获得S1家系,33~#XX雌鱼同31~#XY雄鱼杂交获得S2家系、30~#XX雌鱼同31~#XY雄鱼杂交获得S3家系。将每个家系受精后1天(1 day post-fertilization,1dpf)的胚胎分成4个处理组进行雌化处理,雌化处理包括激素浸泡和激素投喂两种方式。对照组不作处理。实验1组的处理为1 dpf胚胎苯甲酸雌二醇(Estradiol benzoate,EB)浸泡4 h,仔鱼开口后正常投喂。实验2组的处理为胚胎不做处理,仔鱼开口后EB拌料共投喂60 d。实验3组的处理为1 dpf胚胎EB浸泡4 h,仔鱼开口后EB拌料共投喂60 d。结果显示:S1家系对照组的雌雄比例接近0:1的理论值,S2和S3两个家系对照组的雌雄比例接近1:1的理论值;3个家系实验1组的雌雄比例均接近2:1,平均雌性率为66.76%;3个家系实验2组的雌雄比例大约为1:0,平均雌性率为94.34%;3个家系实验3组的雌雄比例大约为1:0,平均雌性率为94.64%。实验2组以及实验3组的雌性率最高且相差不大,鉴于操作的简便性,在后续实验中可采用实验2组的雌化方式。在3个吉富罗非鱼全同胞家系及其亲本中扩增GM597,通过分析发现其127 bp大小的等位基因与3个家系罗非鱼的X染色体连锁,137 bp大小的等位基因与3个家系罗非鱼的Y染色体连锁。3.XY型转化雌鱼和YY型超雄罗非鱼的培育及其遗传性别的鉴定将吉富罗非鱼混合群体分为两组,每组约1000尾,实验组EB拌料投喂60 d,对照组正常投喂,结果发现:对照组的雌性率为48.23%,实验组的雌性率为95%。从实验组中挑选166个样本,利用GM597共筛选到XY型转化雌鱼75尾。利用已知遗传性别的吉富罗非鱼雄鱼和筛选到的XY型转化雌鱼作为候选亲本进行杂交实验。7~#XY转化雌鱼与36~#YY超雄鱼杂交获得S4家系,11~#XY转化雌鱼同31~#XY雄鱼杂交获得S5家系,19~#XX雌鱼同28~#XY雄鱼杂交获得S6家系。采用干法授精,并在孵化装置中进行受精卵的孵化,待仔鱼开口后开始投喂饵料,在每个家系中随机挑选150个子代扩增GM597,根据结果发现:S4家系的150个子代中有XY型罗非鱼72尾,YY型罗非鱼78尾,两者之比接近理论值1:1。S5家系的150个子代中有XX型罗非鱼36尾,XY型罗非鱼75尾,YY型罗非鱼41尾,三者之比接近理论值1:2:1。S6家系的150个子代中有XX型罗非鱼38尾,XY型罗非鱼73尾,YY型罗非鱼39尾,三者之比接近理论值1:2:1。本实验成功利用GM597筛选到了YY型超雄罗非鱼。
【学位授予单位】：上海海洋大学
【学位级别】：硕士
【学位授予年份】：2019
【分类号】：S965.125
【图文】：

罗非鱼,聚类分析,群体,鉴别率

图 1-1 所有罗非鱼群体的聚类分析图Fig.1-1 Cluster dengrogram of all tilapia populations3.2.4 性别相关微卫星位点的筛选将初步筛选到的 6 个与性别相关的微卫星标记进一步在 12 个群体中扩增后现：GM597 与尼罗罗非鱼无锡群体、尼罗罗非鱼高要群体以及奥利亚罗非鱼番群体的性别显著相关（P<0.05），鉴别率（鉴别率=群体内可准确鉴定性别的个体/群体内个体总数×100%）分别为 39.1%、60.5%与 7.5%；UNH898 与尼罗罗非高要群体的性别极显著相关（P<0.01），鉴别率为 71.1%。将 GM597 与 UNH898合分析可 100%鉴定两个尼罗罗非鱼群体的性别。将 GM597 与 GM258 在奥利亚非鱼无锡群体和奥利亚罗非鱼番禺群体中联合分析，两个群体的雌雄鉴别率分为 33.3%和 40.0%。详细结果见表 1-6~表 1-10。

奥利亚罗非鱼,番禺,群体,等位基因

位点 Locus鉴别率 Identification rates奥利亚罗非鱼无锡群体O. aureus population of Wuxi奥利亚罗非鱼番禺群体Panyu O. aureus populationGM597 2/24（8.3%） 3/40（7.5%）GM258 1/24（4.2%） 1/40（2.5%）GM597-GM258 8/24（33.3%） 16/40（40%）3.3 GM597 与 UNH898 的连锁分析在奥利亚罗非鱼番禺群体中 GM597 与 UNH898 存在高度连锁，GM597 的 99bp 大小的等位基因与 UNH898 的 280 bp 大小的等位基因连锁，GM597 的 111 bp大小的等位基因与 UNH898 的 234bp 大小的等位基因连锁，GM597 与 UNH898 在奥利亚罗非鱼番禺群体中的扩增结果见图 1-2。在 YY1罗非鱼群体中 GM597 与 UNH898 也存在一定程度连锁，GM597 的 127bp 大小的等位基因与 UNH898 的 284 bp 大小的等位基因连锁，GM597 的 137 bp大小的等位基因与 UNH898 的 246bp 大小的等位基因连锁，GM597 与 UNH898 在YY1罗非鱼群体中的扩增结果见图 1-3。

罗非鱼,群体,等位基因,奥利亚罗非鱼

大小的等位基因与 UNH898 的 234bp 大小的等位基因连锁，GM597 与 UNH898 在奥利亚罗非鱼番禺群体中的扩增结果见图 1-2。在 YY1罗非鱼群体中 GM597 与 UNH898 也存在一定程度连锁，GM597 的 127bp 大小的等位基因与 UNH898 的 284 bp 大小的等位基因连锁，GM597 的 137 bp大小的等位基因与 UNH898 的 246bp 大小的等位基因连锁，GM597 与 UNH898 在YY1罗非鱼群体中的扩增结果见图 1-3。图 1-2 GM597 与 UNH898 在奥利亚罗非鱼番禺群体中扩增结果Fig.1-2Amplification results of GM597 and UNH898 in the O. aureus population ofPanyu

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